KRAS>RAF>MEK1/2>ERK1/2信號通路的藥理抑制對胰腺導管腺癌(PDAC)患者沒有臨床益處。聯合抑制MEK1/2(使用曲美替尼[T])和自噬(使用氯喹[CQ]或羥氯喹[HCQ])在臨床前模型和患者(患者1)中顯示出顯著的抗腫瘤作用。然而并非所有患者對T/HCQ方案有反應，患者1最終發展為耐藥疾病。我們報告了原發性或獲得性耐藥與圍繞c-MYC的局灶性DNA拷貝數增加有關。c-MYC在PDAC細胞系中的異位表達使其具有T/HCQ抗性。CDK4/6抑制劑palbociclib (P)也誘導自噬并覆蓋c-MYC介導的T/HCQ耐藥，因此P/HCQ促進了T/HCQ耐藥PDAC腫瘤的消退，c-MYC表達升高?；颊?的P/HCQ治療導致生化疾病反應。這些數據表明，c-MYC表達升高既是T/HCQ抗性的標志，也是一種中介，這種抗性可以通過使用P/HCQ來克服。本文于2023年3月發表于Journal of Experimental Medicine(IF=17.579)。

技術路線：

結果：

(1) 在對曲美替尼+HCQ顯示先天或獲得性耐藥的PDACs中檢測到c-MYC表達升高

我們先前報道了一例PDAC轉移性疾病患者(患者1)在曲美替尼(2mg/d)聯合HCQ治療(1200mg/d, T₂/HCQ₁₂₀₀)?；诿枋?/span>T/HCQ抗腫瘤作用和患者1的癥狀的臨床前數據，我們治療了第二名患者(患者2)，其疾病也在所有標準護理PDAC治療中進展(圖1A)?；颊?/span>2接受了曲美替尼(2mg/d)+HCQ (400mg/d; T₂/HCQ₄₀₀)降至800 mg/d，然后降至1200 mg/d (T₂/HCQ₁₂₀₀)，以使潛在的毒性變得明顯并減輕。患者2的CA19-9水平持續上升(圖1A)，在T₂/HCQ₁₂₀₀治療2個月后，計算機斷層掃描(CT)成像顯示，疾病進展與T/HCQ治療的內在耐藥性一致(圖1B)。患者1最初對T₂/HCQ₁₂₀₀治療有反應，最終獲得耐藥，CT成像顯示CA19-9水平升高和疾病進展(圖1C, D)。隨后對T/HCQ耐藥肺轉移進行活檢，進行(1)免疫組化(IHC)分析，(2)生成患者來源的異種移植(PDX)，以及(3)分析軀體腫瘤DNA。這種轉移也表現出圍繞c-MYC的局灶性拷貝數增加。免疫組化分析顯示，相對于患者1初次手術切除時獲得的原發病灶，T/HCQ耐藥轉移灶中c-MYC表達升高(圖1E)。在T/HCQ治療前采集的肝轉移活檢組織分析發現，第三例患者(患者3)也患有T/HCQ耐藥疾病(圖1F, G)。綜合這些數據，提示c-MYC升高與T/HCQ耐藥之間存在相關性。

圖1：c-MYC表達在對T/HCQ表現出先天或后天抗性的PDACs中升高

(2) c-MYC使PDAC對曲美替尼聯合CQ治療產生耐藥性

突變激活的KRAS通過其典型效應物RAF和PI3K提高c-MYC的表達。相反，在一些PDAC模型中，MAPK信號通路的抑制可抑制c-MYC的表達。為了測試c-MYC表達的升高是否會使PDAC細胞對T/HCQ產生抗性，我們設計了PDAC細胞系，有條件地表達c-MYC^WT或c-MYC^T58A，后者是c-MYC的穩定形式。強力霉素(Dox)治療導致c-MYC表達相對內源性蛋白增加約2-5倍(圖2A, C)。向T/CQ處理的細胞中添加Dox可使c-MYC表達恢復到對照水平的0.7-2.2倍(圖3C定量)。為了評估異位c-MYC表達是否介導體內對T/CQ的耐藥性，將表達Tet-On c-MYC的HPAF-II或PDX220細胞移植到NOD/SCID小鼠中。當給荷瘤小鼠喂食對照飼料(?Dox)時，T/CQ治療顯示腫瘤停滯或消退，c-MYC^WT的異位表達(圖2A, C)或c-MYC^T58A在喂食含有Dox的(+Dox)飼料的小鼠中，腫瘤對T/CQ治療產生耐藥性。當用T/CQ治療的小鼠被喂食Dox飼料以誘導最初對T/CQ治療有反應的腫瘤中的c-MYC表達時，觀察到腫瘤再生，這表明c-MYC表達可以介導獲得性T/HCQ耐藥。相反，從最初耐藥疾病的小鼠中去除Dox飼料導致腫瘤消退，這表明減少c-MYC表達可使腫瘤對T/CQ治療敏感。T/CQ治療組腫瘤的c-MYC和pERK降低，而與Dox聯合治療則恢復了c-MYC的表達(圖2B, D)。

我們假設，T/CQ耐藥細胞中c-MYC表達的降低可能會使這些細胞對T/CQ治療敏感。極光激酶A (AURKA)的抑制劑，如alisertib，通過取消AURKA與c-MYC結合時對FBW7介導的蛋白酶體降解的保護來破壞c-MYC的穩定。alisertib治療PANC-1細胞可降低c-MYC的表達，加入曲美替尼可進一步增強c-MYC的表達(圖2E)。用(1)載體，(2)T/CQ組合，(3)單獨alisertib，或(4)alisertib+T/CQ治療小鼠攜帶的PANC-1腫瘤。PANC-1腫瘤對T/CQ聯合或alisertib單藥治療有耐藥性。然而，alisertib加T/CQ可引起腫瘤消退，這表明通過AURKA阻斷降低c-MYC表達可使T/CQ治療敏感。T/CQ和alisertib治療組腫瘤的c-MYC表達減少，但在alisertib+T/CQ治療組檢測到c-MYC的額外減少(圖2F)。曲美替尼治療導致pERK1/2減少，而CQ治療導致p62SQSTM1增加。這些研究表明，c-MYC表達升高對T/CQ治療具有耐藥性，降低c-MYC表達可能會增加T/CQ耐藥疾病的敏感性。

圖2：c-MYC檢測異種移植胰腺腫瘤對T/CQ的敏感性

圖3：c-MYC表達升高可阻止T/CQ介導的細胞周期阻滯

(3)在曲美替尼+CQ聯合治療時，c-MYC促進細胞周期進展

為了探索c-MYC如何介導對T/CQ的耐藥性，我們檢測了細胞分裂周期，這是由激活的KRAS和c-MYC調節的癌癥的標志之一。為了測試c-MYC表達升高是否會覆蓋T/cq誘導的細胞周期阻滯，我們分析了PDAC細胞系在不存在(-Dox)或存在(+Dox)異位c-MYC時的細胞周期階段。與對照組相比，c-MYC表達增加了處于S期或G2/M期的細胞百分比，在異位c-MYC表達7 d后，S期明顯增加了約5-10%(圖3A, B)。T/CQ處理降低了S期或G2/M期的細胞百分比，但c-MYC^WT的表達(圖3A, B)或c-MYC^T58A(補充圖未展示)克服了這種細胞周期阻滯，并將S期細胞的百分比恢復到控制水平。這些結果表明c-MYC的過表達在體外克服了T/CQ處理后發生的細胞周期阻滯。

為了表征c-MYC表達對細胞周期機制的影響，我們對c-MYC轉錄控制的細胞周期調節因子進行了免疫印跡分析。c-MYC^WT表達對周期蛋白或CDKs(周期蛋白依賴激酶；圖3C)，但c-MYC^T58A增加了HPAF-II和Panc 10.05細胞中cyclins A2和B1的表達(補充圖未展示)。c-MYC^T58A的表達是內源性c-MYC的8-12倍，而異位c-MYC^WT的表達是內源性c-MYC的2-5倍，這可能解釋了c-MYC^T58A對細胞周期蛋白表達的差異影響。隨著時間推移，c-MYC^T58A調節c-MYC靶基因的能力可能發生改變。c-MYC^WT表達導致p27^KIP1表達降低(圖3C)。T和T/CQ處理均降低了視網膜母細胞瘤蛋白(RB)磷酸化和RB、E2F1、A-、B-、D-和E型周期蛋白、CDK2、4和6以及p21^CIP1的總表達(圖3C)。在曲美替尼或T/CQ處理的PDAC細胞中，c-MYC^WT或c-MYC^T58A的表達引發了RB磷酸化(圖3C)。c-MYC并沒有誘導CDK2或cyclin E1的表達。曲美替尼或T/CQ處理的細胞中c-MYC的表達增加了cyclins A2和B1的表達。在細胞周期的最小模型中，細胞周期蛋白A2和B1對于細胞周期的完成至關重要，而周期蛋白A是促進肺細胞系中c-MYC驅動細胞周期進展的主要周期蛋白。這些發現表明，c-MYC介導的細胞周期蛋白A2和B1、RB失活和p27^KIP1減少的作用足以促進T/CQ存在時的細胞周期進展。這些數據表明誘導的c-MYC表達覆蓋T/CQ誘導的細胞周期阻滯。

(4) 藥物抑制CDK4/6誘導PDAC細胞系自噬

KRAS調控的下游信號通路通過調控D型周期蛋白及其伙伴CDK4和CDK6 (CDK4/6)促進G₀>G₁>S期細胞周期轉變。我們評估了CDK4/6抑制劑在PDAC細胞系中調節自噬的能力。細胞周期阻滯和自噬誘導有關聯。為了確定CDK4/6抑制是否調節自噬，我們用palbociclib處理了四種表達mCherry-eGFP-LC3B自噬通量報告(AFR)的PDAC細胞系(圖4A, B)，并觀察了與對照組相比的自噬誘導。為了測試自噬是否由CDK4/6抑制而非palbociclib的脫靶效應誘導，PDAC細胞使用額外的CDK4/6抑制劑(abemaciclib或ribociclib)處理，再次誘導自噬(圖4C)。與DMSO對照相比，palbociclib、ribociclib或trametinib處理的活的MIA-PaCa2^AFR細胞的熒光圖像顯示eGFP陽性斑點的預期減少(圖4D)。palbociclib、abemaciclib或ribociclib對CDK4/6的抑制導致酸性細胞器增加(圖4F, G)，其程度與曲美替尼或Earle’s平衡鹽溶液(EBSS；饑餓控制)類似。為了進一步表征這些細胞器，我們進行了電子顯微鏡觀察，用palbociclib或abemaciclib處理導致單膜和/或雙膜自噬囊泡的大小顯著增加(圖4H, I)。雖然阿貝西庫治療導致囊泡數量顯著增加，但帕博西庫和曲美替尼治療沒有。CQ介導的溶酶體-自噬體融合抑制了Panc 10.05^AFR和MIA-PaCa2^AFR細胞中palbociclil誘導的自噬(圖4E)。

圖4：CDK4/6抑制誘導人PDAC系自噬

(5) 帕博西尼聯合CQ可延緩PDAC體外生長

為了確定CDK4/6聯合溶酶體抑制是否會阻止細胞增殖，我們使用(1)DMSO，(2) palbociclib，(3) CQ或(4)P/CQ處理的細胞進行了體外生長測定。與對照組相比，P/CQ表現出顯著的協同抗增殖作用(圖5A)。與對照組相比，CQ+ribociclib或abemaciclib處理MIA-PaCa2細胞再次產生顯著的抗增殖作用(圖5B, C)。

用曲美替尼治療PDAC細胞可增加G0/G1期細胞的比例；然而添加CQ沒有進一步的影響(補充圖未展示)。為了確定在palbociclib中添加CQ是否對細胞周期進程有進一步的影響，我們用palbociclib或P/CQ處理MIA-PaCa2、PDX220和HPAF-II細胞(補充圖未展示)。與我們觀察到的T/CQ相似，帕博西利加入CQ并沒有增加G0/G1期的細胞比例。

為了確定P/CQ處理是否導致細胞死亡，我們評估了caspase 3/7活性。雖然在MIAPaCa2細胞中，對照組和聯合組之間沒有差異，但P/CQ處理的Panc 10.05細胞中caspase 3/7活性增加(補充圖未展示)。這些數據表明，自噬是一種保護機制，在CDK4/6抑制時促進PDAC細胞生長。

圖5：c-MYC表達升高不能阻止P/CQ介導的細胞周期阻滯

(6) 帕博西尼加CQ可以阻止c-MYC介導的細胞周期進程

鑒于c-MYC能夠克服曲美替尼或T/CQ誘導的增殖阻滯，我們測試了c-MYC表達升高的細胞是否對CDK4/6抑制敏感。與對照相比，palbociclib和P/CQ誘導了顯著的細胞周期阻滯(補充圖未展示)。c-MYC^WT或c-MYC^T58A的異位表達未能克服palbociclib或P/CQ介導的細胞周期阻滯(圖5D)。雖然P/CQ和T/CQ處理對細胞周期調節因子的表達產生了類似的影響，但c-MYC^WT或c-MYC^T58A的異位表達未能促進RB磷酸化或誘導P/CQ后細胞周期蛋白A2或B1的表達(圖5E)。這些數據表明c-MYC不能克服P/CQ引起的細胞周期阻滯。

(7)帕博西尼聯合CQ可誘導c-MYC異位表達的PDAC的腫瘤停滯

為了確定P/CQ治療是否可以在有或沒有c-MYC表達的情況下阻止PDAC腫瘤生長，將小鼠移植到Tet-On表達c-MYC的HPAF-II或PDX220細胞(圖6A, C)，并用(1)載體(對照)，(2)Dox誘導c-MYC表達(Dox)，(3) palbociclib (P，僅在PDX220中)，(4)P/CQ，或(5)Dox+P/CQ (D/P/CQ)處理。無論c-MYC表達如何，P/CQ治療均可阻止腫瘤生長。免疫組化分析證實，在Dox治療的小鼠中，腫瘤生長中的c-MYC表達升高，palbociclib治療時RB磷酸化降低(圖6B, D)。這些結果表明，用P/CQ治療異種移植PDAC腫瘤以c-MYC獨立的方式抑制生長。

圖6：P/CQ阻止表達c-MYC升高的PDAC異種移植的生長

(8) 患者1在帕博西尼+HCQ治療后顯示CA19-9腫瘤標志物減少

在T₂/HCQ₁₂₀₀治療177 d后，患者1在CT成像上表現出疾病進展的跡象，包括CA19-9增加和腫瘤大小(圖7A)。在出現對曲美替尼耐藥后，基于BRAF驅動的PDAC對ulixertinib的明顯敏感性，患者1被切換到ERK1/2抑制劑(ulixertinib)+HCQ的聯合治療。然而患者無反應。肺轉移分析顯示，與原發腫瘤相比，染色體8p包括c-MYC的拷貝數增加?；颊咄饨邮?/span>palbocilclib+HCQ治療。CA19-9水平在治療9 d后下降，并持續10 d，表明對P/HCQ有反應(圖7A)。P/HCQ治療開始3周后，CT成像顯示轉移性肝病灶液化性壞死(圖7B)?；颊叱霈F惡性高鈣血癥(HHM)，檢測顯示甲狀旁腺激素相關肽(PTHrP)升高106.0 pmol/升(正常范圍0-2.3 pmol/升)，提示腫瘤細胞裂解(補充圖未展示)?；颊叩?/span>HHM被成功治療。然而患者未能茁壯成長，并停止了P/HCQ治療，此時他的血清CA19-9水平升高，患者選擇接受臨終關懷。

我們從NOD/SCID小鼠肺病變活檢中建立了PDX模型。免疫組化分析顯示c-MYC的表達與活檢肺病變相似(補充圖未展示)。為了確定患者1對P/HCQ的反應是否由于任何單一藥物的作用，對T/HCQ耐藥腫瘤小鼠進行(1)載體，(2)CQ，(3)曲美替尼，(4)palbociclib，(5) T/CQ，或(6)P/CQ治療?；颊?/span>1的PDX腫瘤對除P/CQ外的所有治療均耐藥(圖7C)，進一步提示P/CQ治療對T/HCQ耐藥且c-MYC表達升高的PDAC有效。對照與藥物治療小鼠的腫瘤免疫組化分析證實(1)c-MYC表達，(2)曲美替尼治療小鼠的pERK1/2降低，(3)曲美替尼和帕博昔利治療小鼠的pRB降低，以及(4)CQ治療小鼠的p62SQSTM1升高(圖7D)。這些結果表明，帕博昔利聯合HCQ可能有效治療c-MYC介導的對曲美替尼和HCQ耐藥的PDAC。

圖7：患者1用P/HCQ治療導致CA19-9和整體腫瘤負荷減少

結論：P/HCQ治療可能是PDAC患者的另一種可能的治療方式，值得在嚴格的臨床試驗中進一步探索。

參考文獻：

Silvis, M. R., Silva, D., Rohweder, R., Schuman, S., Gudipaty, S., Truong, A., Yap, J., Affolter, K., McMahon, M., & Kinsey, C. (2023). MYC-mediated resistance to trametinib and HCQ in PDAC is overcome by CDK4/6 and lysosomal inhibition. The Journal of experimental medicine, 220(3), e20221524. https://doi.org/10.1084/jem.20221524.