TBX2基因位于17q23，常在乳腺腫瘤亞群中過表達。TBX2是一種抗衰老基因，通過抑制腫瘤抑制基因（TSGs），如NDRG1和CST6，促進細胞生長和存活。作者前期研究發現TBX2與PRC2復合體協同抑制多個TSGs，PRC2抑制恢復NDRG1表達從而抑制細胞增殖。在這里，作者現在確定CoREST蛋白LSD1和ZNF217是TBX2的新型互作蛋白。CoREST的遺傳或藥理學靶向模擬TBX2缺失，誘導NDRG1表達，并在體外和體內消除乳腺癌生長。此外，作者發現TBX2/CoREST靶向NDRG1是通過Sp1招募TBX2到NDRG1啟動子上，從而導致NDRG1上調和癌細胞增殖減少來實現的。通過ChIP-seq，作者發現30 %的TBX2結合啟動子與ZNF217共享，并鑒定出TBX2/CoREST抑制的新靶標；在這些靶點中，lncRNA LINC00111作為細胞增殖的負調控因子?？偟膩碚f，這些數據表明抑制CoREST蛋白對TBX2成癮的乳腺腫瘤是一種有前途的治療干預。本研究于2022年6月發表于《Nucleic Acids Res》，IF：19.160。

技術路線：

主要研究結果：

1、LSD1與TBX2相互作用，是乳腺癌細胞存活所必需的

為確定TBX2是否可以形成除PRC2-like復合物以外的其他抑制復合物，作者開展下面的研究。首先，在TBX2依賴的MCF7和T47D乳腺癌模型中，使用56個已知表觀遺傳修飾的核糖核酸內切酶siRNA（esiRNA）庫進行活性篩選；任何導致細胞活力降低的“hits”都可以代表TBX2潛在的功能互作蛋白（圖1A）。取4個“hits”（Hdac7、Sirtuin-3（SIRT3）、LSD1和Jumonji Domain-Containing 2B（JMJD2B）/KDM4B），對其在兩種細胞系的活力進行下游驗證。用兩個獨立的siRNA敲低每一個候選基因，48 h后的細胞活力實驗發現，SIRT3和LSD1對MCF7細胞活力明顯增強，但在MCF10A正常乳腺細胞中沒有（圖1B-C）。然而，在這些短期敲低中，LSD1敲低對TBX2靶標CST6的mRNA上調表現出最顯著和可重復的效應，與CST6通常抑制的酶Legumain活性降低相一致（圖1D-E）。這表明LSD1可能是TBX2可能的互作伙伴。免疫共沉淀實驗證實，在MCF7和T47D模型中，TBX2和LSD1之間存在物理相互作用（圖1F）。這些數據表明TBX2可能與多種表觀遺傳調控因子相互作用，抑制LSD1可作為靶向TBX2依賴性乳腺癌的可行策略。

作者下面確定TBX2-LSD1相互作用是否存在轉錄復合體中轉錄因子與其他染色質調控蛋白的相互作用影響蛋白的穩定性。首先，靶向TBX2的siRNA處理MCF7細胞72h后，細胞增殖能力降低，同時伴隨著靶基因NDRG1和CST6的上調；然而，Western blot分析顯示這獨立于對LSD1蛋白水平的影響（圖2A）。同樣地，用兩個獨立的siRNA敲低LSD1，TBX2的敲低效果類似，但TBX2的RNA和蛋白沒有相應的減少（圖2C）?？寺⌒纬蓪嶒炓沧C實，LSD1和TBX2敲低對長期生存的影響相當，克隆數顯著減少（圖2B-D）。這些現象在第二個細胞系（T47D）中也是一致的，敲低TBX2或LSD1導致類似的細胞增殖減少和NDRG1/CST6上調，而在蛋白水平上不影響彼此的穩定性（圖2E）。結晶紫生長實驗再次證實TBX2和LSD1是T47D細胞克隆存活所必需的（圖2F）。綜合這些數據表明，雖然TBX2和LSD1對蛋白穩定性沒有相互要求，但兩者的相互作用可能對抑制TBX2靶基因和維持乳腺癌細胞生長具有重要意義。

圖1 LSD1與TBX2相互作用。

圖2 LSD1敲低TBX2表型缺失。

2、變構LSD1抑制劑SP-2509在體內抑制TBX2靶點并抑制雌激素依賴的乳腺腫瘤生長

在確定LSD1是TBX2的一個新的細胞增殖所需的相互作用因子后，作者通過檢測LSD1抑制劑SP-2509、RN-1和GSK-LSD1來研究這種依賴性是否可以被藥理學靶向。首先，MCF7和T47D細胞暴露于濃度遞增的LSD1抑制劑（圖3A）。在測試的3個抑制劑中，只有SP-2509顯示出降低細胞增殖的效果，72 h時對MCF7的IC50為250 nM，對T47D的IC50為1 M。兩株細胞均對RN-1和GSK-LSD1的作用高度耐藥，在最大20 M劑量下無法達到IC50；事實上，GSKLSD1確實促進MCF7（可能是由于脫靶效應）的生長。Western blot結果顯示，IC50劑量的SP-2509處理后，NDRG1的表達顯著上調，而20 M RN-1或20 M GSK-LSD1則無此作用。與作者之前觀察到的LSD1敲低后TBX2的表達情況類似，SP-2509干擾LSD1的活性后TBX2的蛋白水平沒有受到影響。在MCF7細胞中，NDRG1的上調與H3K4二甲基化（H3K4me2）的整體增加相關，而在T47D細胞中，NDRG1的上調與該組蛋白標記不相關，表明H3K4me2的整體變化是SP-2509處理的間接效應（圖3B）。無論H3K4me2水平如何，用SP-2509 IC50處理兩種細胞系均導致靶基因NDRG1和CST6的轉錄顯著上調，而RN-1或GSK-LSD1在20M時幾乎沒有影響（圖3C-D）。相應地，SP-2509處理導致CST6靶點Legumain的活性顯著降低（圖3E）。接下來，作者利用Tet-off誘導模型探討SP-2509是否可以發揮TBX2依賴的表型；該基因表達一個顯性負調控TBX2蛋白（DN-TBX2），由包含完整T結構域的1-301個氨基酸組成，但缺少抑制結構域所在的302-701個氨基酸。有趣的是，SP-2509的抗增殖作用在誘導表達截短型TBX2的MCF7細胞中更加明顯（圖3F），同時伴隨著靶標NDRG1和CST6的上調，顯著高于單獨處理組（圖3F）。值得注意的是，DN-TBX2對LSD1蛋白表達的影響可以忽略不計，這表明這種對SP-2509的敏感性增強不是由于藥物靶標的下調。為確定SP-2509是否能在體內抑制乳腺腫瘤的生長，用MCF7細胞移植雌激素補充的小鼠，用40 mg/kg的SP-2509或溶劑處理4周（圖3G）。終點免疫組織化學染色發現，SP-2509處理的腫瘤組織中增殖標志物Ki-67的表達約為溶劑對照組的一半（圖3H）?？偟膩碚f，這些體外和體內的數據表明，SP-2509特異性靶向LSD1的H3變構位點，可以導致TSGs的有效上調，并可能是用于開發乳腺癌中的TBX2依賴性的一個可行的治療方案。

圖3 一種變構LSD1抑制劑增強tbx2抑制基因的表達，并在體內阻止乳腺腫瘤的生長。

3、TBX2與CoREST復合體的組件相互作用

對TBX2敲低后上調的轉錄本進行ChEA富集分析，發現ZNF217是第二顯著的TF結合位點（圖4A）。因此，作者推測TBX2可能與ZNF217相互作用，除LSD1外，還可能與CoREST復合體的其他成員相互作用。因此，從MCF7和BT474細胞提取物中免疫沉淀ZNF217，證實了除CoREST組分LSD1和HDAC1外，還與TBX2存在物理相互作用（圖4B）。這表現在TBX2的下拉互作中，表現為與ZNF217、LSD1和HDAC1的正向互作（圖4C），重要的是，這些數據再現之前的發現，TBX2可以與HDAC1相互作用，這被證明依賴于TBX2的C端。

通過兩個獨立的ZNF217 siRNA序列處理TBX2依賴的細胞，評估ZNF217對TBX2依賴的細胞存活的重要性，這導致目標NDRG1和CST6的生長顯著降低和轉錄上調（圖4D）。與LSD1一樣，ZNF217敲低后NDRG1的上調與TBX2蛋白表達的變化無關，反之亦然（圖4E）。在BT474和T47D乳腺細胞系中進一步證實了這種依賴性，其中ZNF217的敲低導致NDRG1顯著上調并顯著降低克隆形成率（圖4F）。

為了進一步評估CoREST依賴性，通過增加抑制劑MS-275（恩替諾特）的劑量處理表達TBX2的細胞72 h，證實其對I類HDACs的敏感性，其在MCF7和T47D細胞中的IC50分別為1.5 M和0.5 M。由于多個CoREST相關蛋白的敲除可以解除對TBX2靶點的抑制，因此提出同時抑制多個復合物成員應該導致明顯的表型。因此，作者發現低劑量的SP-2509和恩替諾特（IC50以下）對NDRG1/CST6的生長抑制和轉錄上調作用明顯大于單藥處理（圖4G）。這些結果表明，TBX2與CoREST蛋白LSD1、ZNF217和HDAC1之間的相互作用和協調活性可能是抑制TSGs促進乳腺腫瘤存活所必需的。

圖4 TBX2與CoREST抑制復合物的組分相互作用。

4、TBX2和ZNF217顯示出截然不同和重疊的全局DNA結合譜

基于作者的證據，TBX2與CoREST因子共同存在于抑制復合體中，作者進一步將作者的內部TBX2數據與公開的MCF7進行了比較該復合物中關鍵蛋白的ChIP-seq。由于缺乏高質量的LSD1公共數據以及作者無法通過甲醛方案實現LSD1富集，作者利用ZNF217 ENCODE ChIP-seq數據來代表潛在的CoREST靶向區域。作者發現30 %的TBX2結合位點與ZNF217峰中心重疊，這些峰的平均信號富集度在兩種蛋白中高度相似（圖5A）。與ZNF217重疊的TBX2峰主要見于啟動子區域（圖5B），激酶富集分析顯示其富集于PDGFRA下游靶基因（圖5C）。有趣的是，這些TBX2/ZNF217重疊峰對之前發現的CTCF和NF-Y基序缺乏富集，而對Fos/Jun（AP-1）、THAP11、GABPA和Sp1共有序列顯示顯著富集（圖5D）。相反，ZNF217信號缺失的其余TBX2位點富集在Sp1、CTCF、NF-Y和CREM基序，而AP-1、THAP11和GABPA基序沒有富集；綜上表明ZNF217影響TBX2在AP-1、THAP11和GABPA位點的定位，而ZNF217本身不經常發生在TBX2結合的NF-Y、CTCF和CREM位點。相應地，對TBX2信號缺失的ZNF217結合位點分析發現，THAP11、AP-1、GABPA和CTCF基序顯著出現，而NF-Y和CREM序列沒有富集（圖5D）。作者進一步檢測TBX2和ZNF217的結合位點，其中包括CoREST復合物關鍵組分RCOR1的ENCODE公共ChIP-seq數據。三個蛋白均富集的靶基因可能代表TBX2-CoREST抑制基因。雖然部分TBX2/ZNF217共享區域顯示重疊的RCOR1信號，但在ZNF217結合（圖5E）的剩余TBX2位點中沒有觀察到中心RCOR1富集。這些數據突出表明ZNF217對于RCOR1定位到TBX2靶區域是必不可少的，并且發現了一組TBX2可能與CoREST蛋白相互作用以實現轉錄抑制的目標啟動子。ZNF217對TBX2-CoREST抑制的重要性也可能解釋為什么SP-2509破壞復合物中ZNF217的相互作用可以有效地去抑制TSGs和抑制乳腺癌細胞增殖。

圖5 ZNF217與乳腺癌細胞中三分之一的TBX2結合位點重疊。

5、Sp1對于TBX2介導的NDRG1抑制至關重要

鑒于MCF7 ChIP-seq中TBX2結合位點最富集于Sp1基序，作者推測Sp1可能與TBX2介導的基因抑制有關。免疫共沉淀實驗證實TBX2與Sp1存在相互作用（圖6A）。接下來，作者檢測NDRG1位點對Sp1識別位點的影響（圖6B）。與其他在電子數據庫中鑒定的TBX2/CoREST靶點相比，NDRG1位點的TBX2、ZNF217和RCOR1結合位點的排列遵循非典型模式；而在啟動子TSS處存在明顯的TBX2和RCOR1峰，該區域缺少一個較強的ZNF217峰。相反，ZNF217結合被發現富集在NDRG1位點3 '端內含子區域，與RCOR1共定位。重要的是，位于內含子10的區域被歸類為“基因內增強子”，在GeneHancer雙精英數據庫中被編目以靶向NDRG1 TSS（圖6B）。內含子10作為NDRG1的內部增強子的證據被公開的MCF7數據進一步證實，表明該區域在3D實驗中與啟動子存在物理相互作用；啟動子和內含子也被富集到組蛋白修飾H3K27Ac和組蛋白H3第4位-甲基化，活性增強子的標志。因此，NDRG1啟動子上缺乏強的ZNF217信號可以通過染色質環化來解釋，從而影響蛋白質從一個復合物固定到兩個明顯不同的DNA區域。有趣的是，主上皮因子GRHL2（CCNGTTNNNCNAG）的基序在NDRG1啟動子和第10內含子的ChIP峰中心都存在（圖6B），而完全保守Sp1序列（GGGGCGGGGC）特異于TBX2峰的中心啟動子處。鑒于之前的研究發現GRHL2和Sp1分別是參與ZNF217和TBX2在MCF7細胞中全局結合的關鍵基序，這些觀察結果是擬合的（圖5D）。有趣的是，TBX2與GRHL2存在物理互作（圖6C）。然而，在TBX2依賴的細胞系中，單獨敲低Sp1被認為足以使NDRG1上調（圖6D），而該蛋白的丟失顯著降低了長期生存（圖6E）。匹配mRNA的分析也證實Sp1缺失后NDRG1的上調發生在轉錄水平（圖6F）；因此，這些數據表明Sp1可能對NDRG1的抑制和維持細胞增殖有重要作用。對作者的TBX2 ChIP-seq數據進行分析發現，Sp1基序主要位于TBX2峰頂100bp內，表明這兩個因子之間存在協同或競爭的DNA結合（圖6G）。在NDRG1位點，ChIP PCR顯示Sp1敲低后TBX2與啟動子/ TSS區域的結合明顯減弱（圖6H）。作者觀察到siRNA敲低NDRG1部分挽救TBX2和ZNF217敲低的抗增殖作用（圖6I-J）。這些結果表明TBX2-CoREST復合物對NDRG1的轉錄抑制是通過Sp1招募TBX2到NDRG1啟動子上實現的。雖然NDRG1在TBX2/CoREST缺失后發揮抑癌作用，但其他一些靶基因（潛在的新型TSGs）可能參與了這一表型，因此需要進一步研究。

圖6 Sp1通過招募TBX2到NDRG1啟動子來抑制TSG NDRG1。

6、LINC00111被TBX2-CoREST抑制，在乳腺癌細胞中表現出腫瘤抑制活性

鑒于ZNF217在MCF7 ChIP-seq中占據了大量的TBX2結合位點，作者確定了這些區域中的哪些區域代表了TBX2-CoREST抑制基因，這些基因可能具有腫瘤抑制功能。在包含RCOR1的TBX2/ZNF217結合區域的子集中，作者篩選出7個啟動子，它們的轉錄本因TBX2或ZNF217功能的喪失而持續上調；其中6個基因為蛋白編碼（CELSR2、CORO2A、CTNND2、GOLT1A、KLHL20、PTK6），1個基因為長鏈非編碼RNA產物（LINC00111）（圖7A）。這些基因在TF結合位點內都至少含有一個之前發現的顯著性基序（圖5D）。LINC00111啟動子與其他區域不同，TBX2峰含有CREM基序，在TBX2結合位點整體中較少出現（圖7A）。作者發現這7個基因都受到TBX2-CoREST的轉錄抑制，用TBX2 siRNA或ZNF217/LSD1抑制劑SP-2509處理后，相關的RNA顯著上調。LINC00111被發現是上調最強烈的轉錄本，其誘導倍數與NDRG1相當（圖7B-C）。

作者為確定TBX2-CoREST抑制靶點是否在細胞生長和存活中發揮作用，在缺乏和存在LINC00111 siRNA的情況下敲低TBX2，比較對細胞生長的影響（圖7D）。結果發現，LINC00111 siRNA處理顯著挽救TBX2 siRNA以及HP1和KAP1敲低的抗增殖作用（圖7D）。有趣的是，單獨使用LINC00111 siRNA處理導致TBX2蛋白顯著上調，這自然與TBX2 siRNA的作用相反（圖7D，1）；這暗示LINC00111本身可能作為TBX2的阻遏物。此外，LINC00111 siRNA基底降低了促衰老因子細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的蛋白水平，同時阻止了TBX2 siRNA對細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的上調作用（圖7D，5、6）。LINC00111 siRNA不影響HP1 /KAP1的蛋白表達（圖7D，2、3）；然而，通過LINC00111 siRNA處理（圖7D，5、6），HP1/KAP1敲低對細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的上調作用大大降低。相反，LINC00111 siRNA不能挽救EZH2敲低的抗增殖作用，也不能導致細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的上調（圖7D，4、5、6）。這些數據表明LINC00111在與細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1誘導相關的生長停滯中發揮重要作用。

為進一步證實LINC00111在生長阻滯中的作用，在MCF7和MDA-MB-361細胞中重復實驗，其中TBX2在LINC00111 siRNA存在和不存在的情況下被敲低。RT-qPCR證實TBX2缺失后LINC00111表達上調，LINC00111 siRNA干擾后LINC00111表達下調。如前所述，LINC00111敲低引起TBX2本身的上調（圖7E-F）。在這兩種細胞系中，LINC00111敲低阻止了TBX2 siRNA對細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的上調，并部分挽救了增殖標志物CDK1的丟失（圖7F）。在長期實驗中，LINC00111敲低也顯著降低了TBX2 siRNA對克隆形成的不利影響（圖7G）?？偟膩碚f，這些結果表明LINC00111通過調節TBX2和細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的表達而具有腫瘤抑制特性，因此當被TBX2-CoREST復合物靶向抑制時，對癌細胞存活具有重要的影響。

圖7 LINC00111是TBX2-CoREST的轉錄抑制靶點，具有抑瘤活性。

結論

總之，作者鑒定了一個由TBX2抑癌基因形成的新的轉錄復合物。TBX2對其他轉錄因子的重新配置以及與多個抑制復合物的界面的適應性使其成為一個非常強大的致癌基因。

圖8 TBX2-CoREST抑制NDRG1靶基因的機制。

參考文獻

McIntyre AJ, Angel CZ, Smith JS, Templeman A, Beattie K, Beattie S, Ormrod A, Devlin E, McGreevy C, Bothwell C, Eddie SL, Buckley NE, Williams R, Mullan PB. TBX2 acts as a potent transcriptional silencer of tumour suppressor genes through interaction with the CoREST complex to sustain the proliferation of breast cancers. Nucleic Acids Res;50（11）:6154-6173. doi: 10.1093/nar/gkac494.