慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種常見的呼吸系統疾病，其發病復雜性與衰老/吸煙密切相關，但人們對其了解甚少。本研究利用單細胞測序技術闡明COPD的發病機制，并證明了靶向單核細胞在COPD診斷和治療中的潛力。本研究于2022年12月發表在《Respiratory Research》IF：7.162期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、在不同條件下細胞類型特異性基因表達改變

作者對3例COPD患者，3例年齡匹配的老年對照，3例年輕的對照的肺組織樣本進行scRNA-seq檢測，其中4例主動吸煙者（AS）和5例從不吸煙者（NS）。然后按照圖1所示的流程和方法建立一個新的綜合COPD病理模型，并闡明衰老和吸煙是如何促進COPD發展的。

圖1 scRNA分析流程圖。

質量控制之后，共計注釋到15種類型的細胞，包括14種已知細胞類型，包括巨噬細胞，樹突狀細胞，單核細胞，肥大細胞，中性粒細胞，自然殺傷細胞，T細胞，B細胞，肺泡1型細胞（AT1），AT2，俱樂部細胞，纖毛細胞，基質細胞和內皮細胞，以及一種被稱為增殖細胞的細胞增殖標記高度陽性的獨特未知聚類，在最近發表的人類肺組織scRNA-seq數據集中也被檢測到（圖2A）。為了以細胞類型特異性的方式獨立評估與COPD、衰老和吸煙相關的分子改變，采用線性混合模型來識別每種條件下的差異表達基因（DEGs）。衰老相關的DEGs富含衰老的分子特征，反映了老年受試者的衰老肺部的一般狀況；與吸煙相關的生物過程是最不同的，但它們仍然強調吸煙誘導的細胞應激和脂質代謝和囊泡運輸的變化（圖2C）。為了進一步揭示與COPD相關的基因，作者發現免疫細胞中與COPD相關的DEGs主要來自單核細胞，包括NF-κB信號基因，如REL、IL1B、KLF4和FLNA；在非免疫細胞中，最高的DEGs來自AT2s和俱樂部細胞，包括AZGP1、SNRPG、HNRNPM、EIF3E、TIE1和IL7R（圖2C）。將GWAS數據與COPD相關基因整合在一起，以確定影響COPD遺傳性的細胞類型，并證明GWAS COPD風險基因在單核細胞中的DEGs中大部分過高，其次是at2和內皮細胞（圖2D）。為了確定COPD、衰老和吸煙下的優先細胞類型，對數據進行了下采樣，以比較所有細胞類型中相同數量的細胞，發現COPD中單核細胞的DEG數量最多，而衰老和吸煙下的俱樂部細胞和巨噬細胞分別是受影響最大的類型（圖2E）。這一發現得到了AUGUR的驗證（圖2F）。兩項分析都顯示，在所有條件下，單核細胞都是最優先的細胞類型；因此，是接下來分析的重點。

圖2在不同條件下細胞類型特異性基因表達改變

2、單核細胞的條件特定狀態顯示了系統級異常的快照

鑒于單核吞噬細胞系統（MPS）中細胞類型的共享功能和轉錄組相似性，我們首先通過將我們的數據與最近發表的2個肺scRNA-seq數據集進行比較，排除了聚類錯誤的可能性。接下來，進行GSEA分析，結果發現在COPD中，主要由NF-κB和TNF信號介導的炎癥反應在單核細胞中異常激活（圖3A），以及一些下游過程，如細胞凋亡和白細胞遷移的負調控（圖3B），這清楚地表明單核細胞是先天免疫的組成部分。值得注意的是，參與IFN-γ產生的基因，包括典型的IFN-γ刺激因子IL18，在衰老單核細胞中顯著上調（圖3C, D），這表明IL-18介導的信號通路負責炎癥的維持。最近的研究表明，端粒功能障礙可通過YAP1復合物誘導IL-18介導的信號通路激活。本研究表明，衰老單核細胞中下調的DEGs在DNA損傷反應和端粒維持方面得到豐富（圖3C）， YAP1復合物的成分，以及對炎癥小體激活和YAP1穩定至關重要的2種去泛素酶都顯著激活，即USP7和USP47（圖3D）。與慢性阻塞性肺病和衰老單核細胞形成鮮明對比的是，活躍吸煙者肺中的單核細胞主要功能為抗原呈遞細胞(APCs)，與活躍吸煙者相比，參與MHC II類抗原呈遞的基因在上調的DEGs中過高（圖3E）。本研究和其他研究一致將CD14+中間單核細胞定義為單核細胞群體中的APCs，作者觀察到活躍吸煙者中中間亞型的比例大幅增加（圖3F）。為了排除細胞組成的偏差僅僅是隨機抽樣的結果的可能性，進行了軌跡分析，以確定負責單核細胞從經典亞型分化到中間亞型的潛在驅動基因。發現吸煙相關的DEGs確實在驅動基因中富集，而COPD或衰老相關的DEGs則沒有（圖3G）。在圖3H的示意圖中總結了關于單核細胞獨特免疫作用的關鍵點，還利用最近發表的COPD scRNA-seq數據集驗證了這些發現。基于優先考慮的細胞類型可能對疾病表型的反應或貢獻最大，因此它們的狀態在某種程度上可以作為揭示系統級異常的原因。與預期一致，炎癥反應和細胞因子的產生在COPD相關的環境中更為普遍，通過MHC II類抗原呈遞在吸煙相關的APC中更為活躍。特別的是，觀察到在老化的結構細胞中通過MHC I類廣泛激活抗原呈遞，對應于老化單核細胞介導的Th1細胞反應的誘導（圖3I）。總之，最優先的細胞類型，即單核細胞，在COPD發病機制中是一個關鍵的部分，特別是當衰老和吸煙嚴重參與時。

圖3單核細胞的條件特定狀態顯示了系統級異常的快照

3、“COPD核心”病理:改變細胞間通訊和單核細胞對AT2s的促凋亡作用

在COPD相關單核細胞中，促炎信號通路的激活和細胞因子的產生表明，這種優先考慮的細胞類型可能通過細胞間通信驅動其他細胞類型的轉錄改變。因此，進行了連接組分析，以確定對照組和COPD肺之間細胞-細胞相關作用（CCIs）的差異。通過測量15種細胞類型中CellPhoneDB預測的配體-受體對數量的差異來量化CCIs的變化。總體而言，先天免疫細胞與非免疫結構細胞之間的CCIs增加，單核細胞中尤其明顯（圖4A）。然后將重點放在從對照組到COPD肺中預測配體-受體相互作用增加10%的CCI上，結果發現AT1和AT2都表現出與單核細胞的相互作用的增強最大（圖4B）。一個關于單核細胞和肺泡上皮細胞間CCI增強的配體-受體對圓環圖說明由于表達顯著改變導致幾種促炎因子在COPD相關單核細胞中上調，包括IL-1β、TNF和EREG（圖4C）。為進一步探究單核細胞與肺泡上皮細胞相互作用的下游分子機制，作者進行了NicheNet分析，以優先考慮最能預測COPD相關肺泡上皮細胞中DEG的配體。在最優先的配體中，IL-1β和TNF被預測是有影響力的上游配體，可以調節兩種肺泡上皮細胞類型中NF-κB和MAPK通路中的許多基因（圖4D）。根據這一發現，metscape的上游分析預測，NF-κB、IL-1、TNF和MAPK信號通路中的幾個轉錄因子可能調控AT1s和AT2s中識別的DEG（圖4E）。總之，分析表明，COPD相關單核細胞中促炎信號通路的激活導致CCIs升高，特別是IL-1和TNF信號通路，可能是COPD肺泡上皮炎癥的主要驅動因素。

為更好地表征信號拓撲，進行WGCNA分析，以尋找表達水平高度相關的COPD相關基因簇，并發現了一個被稱為Blue模塊的838個基因模塊，其總體表達在COPD中顯著上調（圖4F, G）。使用富集圖揭示了Blue模塊主要生物過程的功能拓撲（圖4H），包括外部刺激（細胞對化學刺激的反應），細胞損傷（凋亡過程和程序性細胞死亡），以及與圖4E中預測的信號級聯MAPK家族信號級聯，強烈地將AT2s中的細胞損傷歸因于IL-1β和TNF等促炎配體介導的單核細胞的外部免疫刺激。隨后，利用STRINGDB為圖4H中富集在2個以上生物過程中的Blue模塊基因編碼的蛋白構建了功能相互作用網絡，以更好地展示與COPD相關的AT2s中的關鍵生物過程及其相互關系（圖4I）。該網絡清楚地表明，來自單核細胞的外部刺激，特別是以IL-1β和TNF為代表，通過內質網應激、線粒體功能障礙和MAPK信號通路導致AT2s凋亡，其中幾個樞紐蛋白通過NF-κB信號通路連接（圖4I）。綜上所述，建立了“COPD核心”發病機制的信號通路，從單核細胞分泌促炎因子開始，通過CCIs傳遞信號，最終導致AT2s凋亡，抑制AT1s分化，從而導致肺泡上皮損傷后修復失敗。

圖4“COPD核心”病理：改變細胞間通訊和單核細胞對AT2s的促凋亡作用

4、衰老促進COPD發展的潛在機制:衰老的俱樂部細胞調節的自身免疫性氣道小生境是氣道上皮損傷的基礎

由于俱樂部細胞是最優先考慮的衰老相關細胞類型（圖2E和F），作者將注意力集中在俱樂部細胞上，以說明衰老可能促進COPD發展的潛在機制。熱圖列出了來自老年人和年輕人肺部的俱樂部細胞之間最大的生物學變化，揭示了衰老俱樂部細胞的一個獨特的亞群，其特征是衰老，如蛋白質平衡的喪失（IRE1介導的未展開蛋白反應的調節）和細胞衰老（有絲分裂細胞周期的負調控），這些主要來自COPD肺樣本（圖5A）。值得注意的是，在所有4種類型的氣道上皮細胞中，MHC I類抗原呈遞途徑的單細胞功能富集與細胞周期和IFN-γ介導的信號通路的負調控高度相關（圖5B）。提示自身免疫易感性、IFN反應性和上皮細胞衰老與COPD病理之間的潛在聯系。

IFN受體編碼基因，包括IFNGR1、IFNGR2、IFNAR1和IFNAR2在氣道上皮細胞中隨著年齡的增長而顯著增加（圖5C）。MHC I系統的重要成分，尤其是B2M在老化的氣道上皮細胞中普遍上調；FGFR2的表達在衰老的俱樂部細胞中下降（圖5C）。鑒于俱樂部細胞是一種多功能的支氣管肺泡上皮前體細胞，對氣道上皮的維持具有重要意義，這種負相關性提高了衰老俱樂部細胞的自身免疫可能通過調節FGF信號通路而損害其干性的可能性。進一步鑒定了衰老俱樂部細胞特有的自身免疫傾向亞簇（圖5D），并在COPD肺中富集（圖5A），其中通過MHC I和IFN-γ介導的信號通路的抗原呈遞被顯著激活（圖5E）。接下來，在解析從俱樂部細胞到其他上皮細胞的推斷分化軌跡（圖5F）后，發現在所有三種分化模式中，老年俱樂部細胞在早期階段更加聚集，在自身免疫傾向的老年俱樂部細胞亞集群中更是如此（圖5G）。由于數據顯示細胞衰老和來自衰老肺部的非免疫結構細胞的自身免疫反應，作者通過分析CCI進一步研究了其他細胞類型是否以及如何參與這些過程。有趣的是，衰老的俱樂部細胞表現出與其他細胞類型最強的增強通信（圖5H），這表明這種與衰老相關的優先級細胞類型在調節增加COPD易感的微環境中具有不可忽視的作用。因此，更深入地研究了負責增強俱樂部細胞和其他細胞類型之間CCIs的配體-受體對（圖5I）。衰老的俱樂部細胞表現出增強的NOTCH2介導的與其他上皮細胞的相互作用（圖5I）。總之，這些發現表明，在衰老過程中，自身免疫氣道小位導致氣道上皮細胞毒性損傷，這是由自身免疫誘導的IFN/MHC I軸觸發的，由單核細胞進一步增強，并由衰老的俱樂部細胞調節。

圖5衰老促進COPD發展的潛在機制：衰老的俱樂部細胞調節的自身免疫性氣道小生境是氣道上皮損傷的基礎

5、吸煙促進COPD發展的潛在機制:巨噬細胞和內皮細胞之間有害的細胞間通信導致肺泡損傷

GSEA強調了AS患者肺中先天免疫細胞中通過MHC II類抗原提呈的激活（圖3I）。其中巨噬細胞在AS患者中表現出最大的異質性，所以這種研究巨噬細胞。因此，基于前400個高度可變的GSVA術語，通過k-means聚類來解決異質性問題，并將巨噬細胞分為3個亞型(A、B和C)（圖6A）。亞型A和B的GSVA富集分別在先天免疫反應和通過MHC II類抗原呈遞中發揮作用，因此在很大程度上對應于巨噬細胞的穩態功能（圖6B）。然而，亞型C通過參與線粒體電子傳遞的基因表達來區分（圖6C），這表明該亞型具有獨特的細胞代謝。作者發現AS肺的巨噬細胞中促炎鞘脂生物合成增強，抗炎鞘脂生物合成減少的證據，如吸煙肺中巨噬細胞SPTLC1、SPTLC2、CERS2、CERS5、ASAH1和SGPP1表達增加以及CERK和SMPD4表達減少（圖6D）。此外，在C57BL/6小鼠的香煙煙霧提取物（CSE）處理的BMDMs中觀察到這些基因的表達變化（圖6E），進一步支持吸煙肺部巨噬細胞的促炎鞘脂生物合成。

作者設計了一種新的方法來推斷吸煙巨噬細胞中激活的鞘脂生物合成對其他細胞類型的轉錄組改變的潛在貢獻，該方法同時考慮了配體受體對介導的CCI，因為其他兩種亞型的巨噬細胞參與了先天和適應性免疫反應（圖6B）。簡單地說，首先在個體水平上總結了細胞類型特異性基因的表達，然后檢查了吸煙巨噬細胞中明顯失調的鞘脂代謝酶以及上調的配體的表達是否與個體中其他細胞類型中吸煙相關的DEGs的變化一致（圖6F）。發現，內皮細胞中吸煙相關的DEGs與巨噬細胞中上述失調的鞘脂代謝酶和配體的表達變化具有最高的一致性（圖6G）。從圖6H的Sankey圖可以看出，巨噬細胞中與這些酶相關的基因之間富集的生物過程包括自噬、囊泡轉運和內膜系統組織，而內皮細胞中富集的生物過程包括膜運輸、細胞對脂質的反應和細胞骨架組織。提示促炎的鞘脂類代謝通信可能以囊泡形式從巨噬細胞傳遞到內皮細胞，并可能對吸煙肺中的兩種細胞類型都有損害作用。巨噬細胞和內皮細胞中的幾種酶及其高度相關基因如圖6I所示。總的來說，這些發現表明吸煙引起的肺泡損傷是由APCs介導的，因為APCs增強了抗原呈遞的能力，并以配體和鞘脂代謝物依賴的方式增強了巨噬細胞和內皮細胞之間的細胞間通信，這可能加重COPD。

圖6吸煙促進COPD發展的潛在機制：巨噬細胞和內皮細胞之間有害的細胞間通信導致肺泡損傷

6、通過meta分析驗證三種病理條件下的結果

考慮到COPD的高臨床異質性和研究中肺組織樣本的單中心來源，作者試圖證實他們的發現，特別是在三種情況下（COPD，衰老，吸煙），以優先細胞類型為中心的系統級異常。為此，首先結合了來自不同年齡、種族和吸煙史的健康和COPD患者的9個樣本的scRNA-seq數據集，組合成混合的9+9數據集。然后對9 + 9數據集重復下采樣分析。再一次，在9 + 9數據集的共采樣分析中，單核細胞和俱樂部細胞被優先考慮；COPD和衰老條件下的單核細胞和俱樂部細胞分別被優先考慮（圖7A）。同樣地，在9 + 9數據集的三種條件下，通過使用GSEA富集評分，測量了圖3I中相同生物過程在所有細胞類型中的激活或抑制狀態（圖7B）。盡管9 + 9數據集并沒有完全概括本數據集中每一個生物過程的狀態，但這些數據集在慢性阻塞性肺病肺組織中單核細胞和AT2中普遍存在的炎癥反應以及細胞因子產生方面有大量重疊，并且在老化肺組織中結構細胞中通過MHC I類抗原呈遞的普遍激活以及DNA和端粒調控異常。由于吸煙影響的高度復雜性，吸煙條件下的生物過程狀態比衰老和COPD條件下更不均勻，盡管在9 + 9數據集中，吸煙相關巨噬細胞中的鞘脂生物發生以及吸煙相關APCs中MHC II類介導的抗原呈遞仍然突出。

總的來說，對已發表的scRNA- seq數據的綜合分析表明，本研究發現的失調生物過程所反映的條件優先化細胞類型和系統級異常存在于具有不同遺傳背景和臨床背景的人群中，證實了本研究結果的可靠性和可重復性。

圖7通過meta分析驗證三種病理條件下的結果

如圖8所示，本研究表明“COPD核心”發病機制由單核細胞合成分泌促炎因子開始，經CCIs傳播，最終導致肺泡上皮炎性損傷。在老年肺中，由干性衰竭的衰老俱樂部細胞調節的IFN/MHC I軸誘導的自身免疫性氣道上皮生態位可能通過IFN-γ刺激因子IL18被單核細胞增強，并可能通過氣道上皮細胞毒性損傷促進COPD發展。在吸煙條件下，巨噬細胞和內皮細胞之間依賴配體-受體相互作用和生物激活的鞘脂代謝產物增強的細胞間通信損害了肺內皮屏障，這可能加劇肺泡上皮的炎癥破壞，同時伴隨著通過先天性免疫細胞，包括單核細胞、DC、巨噬細胞和中性粒細胞，MHC II類抗原遞呈能力的增加。

圖8 使用來自人類的COPD肺單細胞圖譜闡明COPD的病理模型示意圖

參考文獻：

Huang Qiqing., Wang Yuanyuan., Zhang Lili., Qian Wei., Shen Shaoran., Wang Jingshen., Wu Shuangshuang., Xu Wei., Chen Bo., Lin Mingyan., Wu Jianqing.(2022). Single-cell transcriptomics highlights immunological dysregulations of monocytes in the pathobiology of COPD. Respir Res, 23(1), 367. doi:10.1186/s12931-022-02293-2