pre-mRNA的選擇性剪接（AS）是真核生物基因表達中的一個關鍵分子事件。AS控制轉錄組的定性多樣性，并擴展蛋白質組的功能庫。此外，癌癥治療中使用的基因毒劑會引起癌細胞轉錄組的重編程。這些變化反映了細胞對壓力的反應，是導致一些耐藥性機制的基礎。本研究分析了順鉑在乳腺癌細胞中誘導的pre-mRNA剪接的全基因組變化。本研究于2022年12月發表在《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》IF：19.160期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、順鉑處理影響mRNA水平和pre-mRNA間接

為描述癌細胞中與DNA損傷相關的轉錄組變化，用順鉑（50 μM，24h）處理MCF-7乳腺癌細胞，并與未處理的對照組進行RNA-seq對比分析。選擇MCF-7細胞是因為它們被認為對這種基因毒性藥物具有相對抗性。差異分析顯示，順鉑處理后共有2310個RNA存在差異表達（DE），其中絕大多數為mRNA，且整體上看順鉑對轉錄本的下調略多于上調（圖1A）。針對“Hallmarks MSigDB集合”對DEmRNA進行GSEA，發現NF-κB和p53通路具有最高的陽性富集評分，MYC靶標和G2/M相關基因是最高的陰性富集評分（圖1B）。GO分析顯示，DEmRNA在多個與DNA損傷應答（DDR）激活兼容的生物過程中富集，包括“信號轉導”、“凋亡過程的正向調控”、“細胞對DNA損傷刺激的反應”或“DNA損傷反應，p53類介質的信號轉導導致細胞周期阻滯”（圖1C）。

AS分析發現，在順鉑處理的細胞轉錄組中，共有2922個AS事件影響1873個mRNA（圖1D）。其中，選擇性剪接外顯子（a-SE，也稱為盒式外顯子）是目前為止最常見的，占總變化的69.9%，影響1433個mRNA。順鉑誘導的a-SE的mRNA在與DNA修復和復制、鏈間交聯修復、細胞-細胞粘附和mRNA加工包括剪接等相關的生物過程中顯著富集（圖1E）。值得注意的是，在受順鉑影響的基因中，只有10.7%（197/1832）含有順鉑依賴的a-SE（圖1F）。此外，與a-SE相關的差異剪接基因（DSG）相關的GO與DEG相關的GO不同，這表明順鉑的轉錄和轉錄后（例如剪接）效應針對不同的基因組（圖1C與圖1E比較）。

圖1順鉑誘導MCF-7細胞中大量轉錄組改變

2、順鉑誘導缺乏E4和5的COASY短異構體的表達

在試圖將順鉑對AS的影響與耐藥機制聯系起來時，作者將注意力轉向了與線粒體功能相關的基因。有趣的是，作者發現9.2%（132/ 1433）的轉錄本經過順鉑介導的a-SE編碼了MitoCarta 3.0（人類線粒體蛋白質和途徑數據庫）中列出的蛋白質；相比之下，只有4.5%的DEG（84/1832）編碼MitoCarta數據庫中存在的蛋白質，這表明順鉑可能優先通過AS影響線粒體相關轉錄本。在132個與線粒體功能相關的AS轉錄本中，作者重點研究COASY，它編碼輔酶A合成酶。RNA-seq分析顯示，在順鉑處理后，COASY經歷了一個復雜的AS事件，包括兩個連續的a-SE（外顯子4和5，E4-5）的跳躍，但是它的表達在mRNA水平和蛋白均未改變（圖2A）。COASY轉錄本中E4-5的跳躍會生成一個較短的COASY亞型，與全長亞型同框，但缺乏獨特的ATP結合位點，因此缺乏催化活性。作者利用位于上游外顯子3和下游外顯子6的外顯子的引物，采用異構體識別終點RT-PCR驗證了COASY E4-5的跳躍（圖2A）。該方法可以同時擴增缺乏和含有E4-5的COASY mRNA異構體，以下分別稱為COASY-short和COASY-FL，并計算剪接比（SOR，即short/FL）。結果發現MCF-7細胞主要表達FL亞型，如SOR值<1，順鉑處理導致短變異比例以劑量和時間依賴的方式增加（圖2B，C）。此外，其他DNA損傷藥劑也可誘導COASY E4-5的跳躍，只是程度不同（圖2D）。同樣，COASY E4-5剪接模式改變的強度與DNA損傷劑對細胞活力的影響相關。喜樹堿和阿霉素對COASY E4-5的影響最強，對MCF-7細胞的毒性也最高（圖2E）。相反，依托泊苷和H₂O₂對MCF-7活性的影響較小，對E4-5包合物水平無影響（圖2E）。這些觀察結果表明，長異構體和短異構體之間的剪接開關可能與對DNA損傷劑的敏感性有關。為驗證這一點，作者比較了COASY E4-5在同源的順鉑敏感和耐藥的卵巢癌（分別為A2780 A和A2780 DDP）、回盲腺癌（分別為HCT8 A和HCT8 DDP）的細胞株中的剪切模式。在兩種細胞類型中，敏感細胞對順鉑的反應中，COASY E4-5的跳躍增加，導致更多的COASY-short亞型（圖2F-G）。相比之下，在耐藥細胞中COASY E4-5剪接不受順鉑影響。總之，這些觀察結果表明COASY短亞型的表達與順鉑誘導的細胞死亡相關。

圖2由順鉑或其它DNA損傷藥物誘導的COASY-短亞型缺失E4和E5

3、缺乏E4-5的COASY-short亞型下調改變線粒體的形狀、功能和順鉑敏感性

為確定COASY-short亞型是否在順鉑敏感性中起作用，通過異位表達或敲除實驗調節其水平。免疫熒光成像顯示，異位表達的COASY-FL或-short亞型主要定位于線粒體（圖3A）。該實驗也揭示了過表達的COASY-short顯著改變了線粒體網絡，表現為拉長的相互連接的線性結構。對具有“管狀”或“碎片狀”表型的細胞進行定性視覺檢查和計數，這是一種常規用于評估線粒體形態的方法，證實了短亞型的表達使裂變/融合平衡傾斜，有利于融合和“管狀”形態（圖3B）。基于這些觀察，接下來通過功能喪失實驗評估COASY-short亞型在順鉑誘導的線粒體動力學和功能變化中的作用。為此，設計了兩個針對E3-E6連接的siRNA，從而特異性靶向短亞型，而對全長轉錄本或蛋白沒有影響。通過冷凍電子顯微鏡觀察線粒體超微結構，發現COASY-short敲除的細胞的嵴密度降低和線粒體腫脹（圖3C）。和文獻報道一致，順鉑促進線粒體融合，并顯著影響對照MCF-7細胞的線粒體網絡，表現為管狀線粒體的細胞百分比從沒有順鉑時的20%上升到順鉑暴露后的80%以上（圖3D，E）。值得注意的是，在COASY-short表達抑制的細胞中，順鉑對線粒體裂變/融合動力學的影響被廢除，表現為這些細胞中的大多數在順鉑處理后保留了碎片化的線粒體網絡。總之，這些實驗表明，順鉑誘導的線粒體變化最有可能是由于COASY-short的表達，而不是由于COASY-FL。

由于COASY-short亞型促進線粒體融合，接下來通過測量氧化磷酸化來評估因COASY-short敲除的細胞的線粒體功能。與對照組比較，在COASY-short亞型敲除的情況下，無論是未處理的還是順鉑處理的細胞，耗氧率（OCR），包括與ATP生成相關的OCR都降低了（圖3F，G）。此外，在沒有順鉑的情況下，COASY-short亞型的缺失對MCF-7的健康和活力沒有影響，但顯著降低順鉑的細胞毒性作用，并增加了細胞耐藥性（圖3H，I）。這些結果表明，COASY短亞型的缺失會降低線粒體融合和活性，并且順鉑誘導會改變AS事件，例如產生COASY-short亞型，從而作用于其毒性。

圖3 MCF-7細胞中COASY-短亞型誘導線粒體融合和凋亡

4、RBM39的失活介導了順鉑對AS的很大一部分作用

接下來，以COASY E4-5的跳躍為典型事件揭示順鉑調控AS的分子機制。在順鉑誘導的1832個DE mRNA中，只有9個（3個上調，6個下調）被注釋到“mRNA通過剪接體剪接”（圖1）。這使得順鉑不太可能通過調節剪接調控因子的表達間接影響AS，雖然這仍然是一種可能性。為鑒定順鉑驅動AS的潛在效應因子，使用先前驗證的siRNA敲除了56個潛在的剪接調控因子，并通過RT-PCR在未處理的MCF-7中監測COASY的E4-5的包含情況。COASY E4-5包合的差異統計為敲除細胞和對照細胞的拼接百分比的差異（圖4A）。為最大限度地提高識別相關剪接因素的機會，只考慮導致剪接變化超過20%的敲除，其中，SF3A1、RBM39和SF3B4的影響最為明顯（圖4A）。SF3A1和SF3B4都是與U2 snRNP相關的剪接因子，耗盡這些一般的剪接因子預計會非特異性地影響許多替代外顯子的剪接。RBM39是一個著名的RNA結合蛋白，已被證明可以調節幾個基因的替代剪接。因此，作者將注意力集中在RBM39上，并測試其可能參與順鉑依賴性調節特定AS的假設。首先，使用兩種不同的siRNA驗證了RBM39的缺失促進了E4-5的缺失，與順鉑類似（圖4B）。為測試這種影響是否僅限于COASY，用siRBM39#2敲除RBM39，并通過RNA-seq分析在全基因組范圍內分析了相關的剪接變化。結果顯示RBM39下調對AS影響較大，共導致7131起AS事件，其中最多的是a-SE（圖4C）。通過比較RBM39依賴的和順鉑誘導的SE，在468個獨立基因上鑒定出577個事件，占所有順鉑誘導SE的28.2%（577/2045），這表明近三分之一順鉑誘導的a-SE也由RBM39控制（圖4D）。引人注目的是，這577個事件中的88%（24.8%E4-5排除率降低，63.6% E4-5排除率增加）受到RBM39基因敲除或順鉑治療的類似影響，而只有12%受到相反的調節（圖4E）。通過RT-PCR分析一系列SEs，驗證了RBM39缺失和順鉑處理對類似陽性和陰性定性轉錄調控的例子（圖4F）。與順鉑類似，敲除RBM39可誘導MCF-7細胞凋亡，但下調RBM39并沒有進一步提高順鉑的死亡率（圖4G）。這些結果說明順鉑誘導AS事件很大一部分依賴于RBM39。

圖4大部分順鉑依賴SE修飾都受RBM39調控

5、順鉑促進了c-Jun和RBM39之間的聯系，并通過減少RBM39與COASY pre-mRNA的結合來控制COASYE4-5的排斥

由于RBM39的缺失和順鉑處理對COASY E4-5的包含有類似的影響，所以作者假設順鉑可能導致RBM39失活。由于作者發現順鉑不能影響RBM39的mRNA和蛋白表達，也不能影響其亞細胞定位。所以，作者在研究順鉑與RBM39之間的聯系時，將注意力轉向了二聚體AP-1 TF的主要成分c-Jun，因為RBM39與可c-Jun特異性結合，并作為AP-1的轉錄共激活劑。重要的是，文獻報道c-Jun可被順鉑激活，通過其反式活化結構域（TAD）的磷酸化和轉錄上調，并參與了幾種癌癥的順鉑耐藥機制。所以，作者假設c-Jun可能會干擾RBM39依賴的剪接。首先，通過共免疫沉淀實驗，在未處理和順鉑處理的MCF-7細胞中監測c-Jun與RBM39的相互作用，結果發現在沒有順鉑的情況下，c-Jun和RBM39之間沒有免疫共沉淀，而順鉑處理導致了兩種蛋白質之間的強大關聯（圖5A）。為驗證順鉑誘導的RBM39和c-Jun之間的關聯不僅僅是c-Jun水平增加的結果，使用基于gagasia熒光素酶酶活性接近互補的替代蛋白-蛋白相互作用試驗驗證了該結果（圖5B）。

作為一種TF，c-Jun的N端TAD結構域在S63/S73和T91/T93殘基被c-Jun N端激酶（JNK）磷酸化激活，這被認為促進了其與共激活劑的相互作用。與此報道一致，使用針對S63、S73和T91的磷酸化特異性抗體的免疫印跡分析顯示，順鉑誘導MCF-7細胞中這些殘基的c-Jun持續磷酸化（圖5C）。然而，添加JNK抑制劑JNK-IN-8減少了順鉑誘導的c-Jun磷酸化，但不影響其與RBM39的相互作用響應順鉑的能力（圖5D）。

作者使用一種特殊方法捕獲直接與RBP結合的RNA，結果與之前的RIP實驗一致，觀察到內源性RBM39向COASY pre-mRNA的募集，而在表達c-Jun的細胞中，順鉑存在時募集減少（圖5E），而在c-Jun KD細胞中未檢測到RBM39與COASY結合的減少（圖5F）。為證實這一模型，評估了c-Jun耗盡對COASY E4-5剪接的影響。在無順鉑的情況下敲除c-Jun對E4-5包含無影響（圖5G，H）。然而，下調c-Jun顯著降低了對順鉑應答的短變異體比例，確立了c-Jun在順鉑介導的COASY AS中的重要性。與這些結果一致， c-Jun的缺失對細胞死亡中的細胞存活沒有影響，但顯著降低了MCF-7對順鉑的敏感性（圖5I）。總之，順鉑誘導的c-Jun相互作用干擾RBM39剪接活性并促進E4-5從COASY mRNA跳躍。

圖5順鉑促進了c-Jun和RBM39之間的聯系，并通過減少RBM39與COASY pre-mRNA的結合來控制COASYE4-5的跳躍

6、c-Jun參與全基因組順鉑誘導的AS，獨立于其轉錄活性

為將發現擴展到COASY之外，通過對c-Jun缺失的MCF-7細胞進行RNA-seq分析，并將其對順鉑的轉錄組反應與對照細胞的轉錄組反應進行比較，評估c-Jun在全基因組順鉑介導的AS中的重要性。發現c-Jun缺失顯著減弱MCF-7對順鉑的轉錄組反應。在穩態mRNA水平上，盡管在siCtl和sic-jun處理的細胞中被順鉑差異調控的基因組在很大程度上重疊，但c-Jun敲除使順鉑調控的mRNA總數減少了約38%（圖6A）。當檢測sic-jun處理的細胞中仍受順鉑影響的960個轉錄本時，觀察到對于其中的80%的轉錄本，在沒有c-Jun的情況下，順鉑的影響都略顯遜色（圖6B）。敲除c-Jun對順鉑誘導的AS有更強的作用（圖6C）。c-Jun在順鉑誘導的剪接反應中的重要性在特異性觀察RBM39依賴與RBM39不依賴的a-SE時更為明顯（圖6D）。因為在沒有c-Jun的情況下，順鉑的作用更低，這些a-SE定義了一組剪接變化，這些剪接變化依賴于c-Jun介導的順鉑處理時RBM39的失活。通過RT-PCR驗證了c-Jun KD對具有代表性的RBM39依賴的a-SE的抑制作用（圖6E）。

作者使用了幾種方法來評估順鉑/c-Jun/RBM39軸調控的a-SE是否優先影響c-Jun靶基因轉錄的mRNA。首先，將相應的基因（n = 468）與分子特征數據庫（MSigDB）中的C3轉錄因子靶基因集進行比較，發現AP-1相關基因集沒有明顯的重疊。然后，建立自己的306個實驗驗證的AP-1依賴基因集，定義為兩個列表TREDD和TRRUST之間的相互作用。在這些高置信度的AP-1靶點和468個交替拼接的基因之間只有7個基因有共同之處，這并不代表明顯的重疊（圖6F）。作者還對照已發表的順鉑處理后BT474乳腺癌細胞中c-Jun結合的209個不同啟動子清單，發現沒有明顯重疊（圖6G）。最后，對公開的MCF-7中c-Jun的ChIP-seq數據集的分析顯示，在不同剪接基因的TSS周圍或a-SE周圍250bp的c-Jun峰沒有明顯富集，如COASY所示（圖6H）。總之，這些結果表明，c-Jun參與順鉑依賴性剪接，獨立于其轉錄功能和它在DNA上的存在。

圖6 c-Jun參與順鉑對基因表達和選擇性剪接的影響

綜上所述，本研究證實順鉑處理促進了c-Jun和RBM39之間的相互作用，阻止了RBM39與COASYpre-mRNA內含子4的結合，導致COASY-short亞型的產生和表達，COASY-short亞型促進線粒體融合和細胞凋亡。

圖7 c-Jun對順鉑作用下COASY pre-mRNA剪接的調控模型

參考文獻：

Lemaitre Florence., Chakrama Fatima., O'Grady Tina., Peulen Olivier., Rademaker Gilles., Deward Adeline., Chabot Benoit., Piette Jacques., Colige Alain., Lambert Charles., Dequiedt Franck., Habraken Yvette.(2022). The transcription factor c-Jun inhibits RBM39 to reprogram pre-mRNA splicing during genotoxic stress. Nucleic Acids Res, undefined(undefined), undefined. doi:10.1093/nar/gkac1130