近年來的研究表明，動態腫瘤微環境(TME)在高級別膠質瘤(HGGs)中的重要性。具體而言，髓系細胞在膠質瘤中介導免疫抑制。然而，髓系細胞是否在低級別膠質瘤(LGG)惡性進展中發揮作用尚不清楚。在本研究中，我們利用單細胞RNA測序在小鼠膠質瘤模型中研究了TME的細胞異質性，該模型重現了從LGG到HGG的惡性進展，為具有惡性進展風險的LGG患者提供治療機會。該研究發表在《CELL REPORTS》，IF：9.995。

研究方法：細胞培養、組織樣本收集、單細胞測序、H&E染色、隨機森林建模、IPA分析、流式細胞術、免疫熒光、Opal、qPCR、生存分析

技術路線：

主要研究結果：

1. scRNA-seq識別膠質瘤進展過程中的動態免疫細胞異質性

未成熟的髓系來源細胞可能限制T細胞浸潤和活化，導致膠質瘤的免疫抑制。為了研究髓系細胞群的異質性以及在LGG惡性進展過程中TME中這種多樣性的功能后果，我們使用了小鼠PDGF-B-驅動的RCAS膠質瘤模型。該模型在大約3 ~ 4周開始形成LGGs，在大約6 ~ 8周進展為HGGs(圖1A)。我們通過流式細胞術檢測CD11b和Gr1 (Ly6c/Ly6g)(一種小鼠髓源性抑制細胞的標志物)，確定了在特定時間點荷瘤動物骨髓中髓系細胞的比例。CD11b+Gr1+細胞增加與腫瘤進展相關。然而，我們的觀察闡明了在攜帶膠質瘤的動物中，骨髓中CD11b+Gr1+細胞擴增的初始時間。

為了研究腫瘤進展過程中髓系細胞類型特異性的轉錄變化，我們對來自無腫瘤動物(NTs;n = 2)、LGG (n = 3)和HGG (n = 3)，使用10× Genomics平臺(圖1B)。在包含所有樣本12,668個細胞的整合數據集中，我們共識別出15個不同的細胞簇，這些細胞簇包括不同的小膠質細胞、巨噬細胞、單核細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、中性粒細胞、血小板和未成熟紅細胞群(圖1C)。我們通過表達每種細胞類型的典型標記(使用點圖(圖1D)和特征圖(圖1E)可視化)來驗證細胞簇的身份。

圖1惡性進展過程中腫瘤浸潤白細胞的單細胞RNA測序

為了確定膠質瘤進展過程中的免疫細胞景觀動態，我們評估了NT、LGG和HGG的髓樣和淋巴樣細胞分布和異質性(圖2A)。我們將巨噬細胞分為以下4種亞型:邊界相關巨噬細胞(BAMs)、膠質瘤相關巨噬細胞(GAMs)、巨噬細胞和中間單核/巨噬細胞(Int Mos/Macs)。我們觀察到，與LGG(4.7%)相比，HGGs中GAMs的比例(以Gpnmb和Spp1表達為標記)增加(20.8%)(圖2A和2B)。我們發現，與NT組(3.5%)相比，LGGs組(9.4%)和HGGs組(8.8%)的Int Mos/ mac均增加。在HGGs中，GAMs的增加也伴隨著T細胞比例的降低(圖2A和2B)。這些數據提示，髓系介導的T細胞募集或擴增抑制。為了驗證這些結果，我們對低級別和高級別胃癌的腫瘤浸潤免疫細胞進行了流式細胞術檢測。我們定量了CD45+細胞中CD45hiCD11b+細胞的百分比，通常被識別為BMDM細胞。我們檢測到HGGs中BMDM細胞的百分比(11.5%±4.5%)比LGGs(2.7±1.5%)增加了4倍(圖2C和2D)。我們觀察到LGGs中CD45+細胞內淋巴細胞(CD11b?CD45hi)的比例(26.9%±12%)明顯高于HGGs(9%±6.6%;p = 0.0197)(圖2F)。我們還計算了淋巴細胞:BMDM細胞(CD45+細胞內)在LGG和HGG中的比例。LGGs中CD45+細胞的淋巴細胞:BMDM細胞比率(10.4±3.8)明顯高于HGGs(0.76±0.34)。這進一步證實了在HGGs中CD45+細胞中的淋巴細胞群比例減少(圖2F)。在63.5%±7%的LGGs和87.3%±5.1%的HGGs中，CD45hiCD11b+細胞也表達巨噬細胞標記物F4/80(圖2C和2D)。在CD45hiCD11b+細胞中，LGG動物(5.5%±3.2%)和HGG動物(10.9%±4.3%)的CD11b+Gr1+細胞(髓源性抑制細胞)的差異無統計學意義(圖2D)。此外，我們通過流式細胞術驗證了患有LGG和HGG的動物大腦中存在T細胞(圖2E)。我們發現LGGs中淋巴細胞群中的T細胞(CD45hiCD11b?)(78.5%±1.4%)明顯高于HGGs(43.4%±11.3%)。同樣，在淋巴細胞群體中，LGGs的CD8+ T細胞比例(33%±6.2%)明顯高于HGGs(8.6%±10.9%)(圖2F)。這些結果支持了我們的scRNA-seq數據，該數據也顯示了HGGs中T細胞浸潤減少。

在正常大腦中觀察到的主要免疫細胞類型是小膠質細胞，81.2%的免疫細胞聚集為小膠質細胞。相比之下，LGG和HGG中分別只有41%和48.3%的免疫細胞是小膠質細胞(圖2A、2B)。在正常大腦中無法檢測到激活的小膠質細胞群;然而，它們分別占LGGs和HGGs的9%和8.5%(圖2A和2B)。

圖2單細胞RNA測序顯示膠質瘤進展過程中免疫細胞浸潤的差異

2. 惡性進展過程中巨噬細胞采用免疫抑制轉錄信號

我們的scRNA-seq分析確定了4個不同的巨噬細胞簇。BAM和Int Mos/Macs表達BMDM細胞的獨特特征(Tgfbi、Cd14和Itga4)(圖3A)，相比之下，GAM和巨噬細胞簇表達了微膠質來源的巨噬細胞的特征(Trem2、Cd9、Cd81、Ctsb、Ctsd和Ctsd)，并表現出BMDM相關基因的顯著下調特征(圖3A)。

BAMs主要參與CNS邊緣區域的清除功能，而已知巨噬細胞的其他亞群也存在于TME中。因此，我們的進一步分析將主要關注非BAMs巨噬細胞亞群，它們在腦TME的背景下更相關。對GAMs、巨噬細胞和Int Mos/Macs的聯合分析表明，HGGs中免疫抑制因子(Mif、Lgals3、Pkm、Axl、Id2和Ccl4)水平較高，而LGGs中募集因子(Ccl5、Cxcl9和Cxcl10)和M1基因(Stat1、HLAII (H2-Aa)和IL-1β)顯著表達(圖3B)。

圖3膠質瘤進展過程中巨噬細胞簇的異質性

3. 惡性進展過程中的異質性和不同的巨噬細胞簇功能

與NT相比，GAM在LGG中Cd74、MhcII (H2-Aa)基因和Stat1表達水平升高，在HGG中ApoE、ApoC1和Timp2表達水平升高(圖3C)。與NT相比，LGG中巨噬細胞Cd74和MHCII (H2-Aa)基因表達水平升高(圖3E)。與LGG相比，在HGGs中ApoE、Timp2、Cd63和Ctsd上調(圖3E)。與GAMs相似，LGG和HGG中巨噬細胞簇的Cd74和Mif表達水平也明顯高于NT (p < 0.005)(圖3F)。附圖4至附圖9顯示：IPA分析發現，與NT相比，LGG的巨噬細胞簇中TNF、IFNG、TREM2和STAT1被激活。與LGG相比，HGG下調IFNG和STAT1，上調CSF1、PPARG和IL-10RA。在Int Mo/Mac聚類中，ApoE、Apoc1、Ctsd、Spp1和Timp2是HGG中差異表達前20位的基因。相比之下，趨化因子Ccl5、Ccl8和Cxcl9是該類群中LGG中差異表達最多的基因。IPA分析發現，與NT相比，LGG中IFNG和STAT1相關通路上調。另一方面，與LGG相比，HGG中IL-10RA、PTGER4和PPARG被激活，而IFNG、STAT1和IFNG下調。我們在HGG中GAM和Int Mo/Mac聚類中發現了前20個上調基因中的Spp1。同樣，Gpnmb是HGG中GAMs中上調最多的基因之一。隨后，我們發現GAMs中同時表達M1和M2標記物。此外，在GAMs、巨噬細胞和Int Mos/ mac中的轉錄譜顯示出較高的預測價值，并且在腫瘤進展期間顯示出免疫抑制進化。我們在GAMs中發現了Apoc1和ApoE，在巨噬細胞中發現了Cd74和MHCII，在Int Mo/Mac人群中發現了MHCII、Cd74、M1極化標簽Stat和趨化因子Ccl5。

4. CD74-MIF軸作為腫瘤浸潤巨噬細胞的靶點

鑒于所有3個巨噬細胞簇似乎都表現出免疫抑制特性，我們確定了LGG期的常見標記物，值得進一步的功能研究。與NT相比，LGG和HGG樣本中的GAMs和巨噬細胞中Cd74及其結合伙伴Mif的表達均顯著上調(圖3D和3F)。同樣，與LGG相比，GAMs和巨噬細胞中促血管生成驅動因子Id2和免疫抑制分子Lgals3在HGG中顯著上調(圖3D和3F)。

為了評估CD74在荷瘤動物中的原位表達，我們對NT、LGG和HGG的組織切片進行了CD74和CD68的聯合染色，并進行了全腫瘤組織成像，共分析了367個FOVs。我們發現，與NT(0.07%±0.2%)相比，HGG(3.4%±5.8%)和LGG(1.4%±2.9%)的CD74陽性細胞比例顯著增加(圖3G)。然后，我們用qPCR方法驗證了從TME分離的免疫細胞中Cd74和Id2的表達。我們發現與LGG相比，HGG中Cd74和Id2的表達明顯增加(圖3H)。流式細胞術染色也顯示，與LGG(3.9%±1.7%)相比，HGGs在CD45hiCD11b+細胞中過表達CD74(31.9%±16.2%)(圖3I)。我們在LGG和HGG患者中均發現CD74+CD206+細胞。然而，LGG患者的CD74+CD206+細胞數量顯著增加(圖3J)，證實了浸潤性人腦膠質瘤巨噬細胞中CD74的表達。

5. HGG TME中T細胞運輸和激活的限制

我們觀察到，與HGG樣本相比，LGG中的T細胞浸潤增加(圖2B和S2A)。CD3+ T細胞占LGGs免疫浸潤的6.4%，而在每個樣本中，正常腦和HGGs的CD3+ T細胞比例分別不到0.08%和2.1%(圖2B和S2A)。為此，差異表達分析發現，在LGG的浸潤T細胞中，趨化因子(如Ccl8、Cxcr6、Ifn-γ和Ccl5)上調(圖S11)。相比之下，HGG中的免疫浸潤T細胞表達更多與脂質代謝相關的分子，如ApoE、Apoc1、Hmox和Fabp5(圖4A)。

接下來，我們研究了低級別GGS和高級別GGS之間總CD3+ T細胞的基因表達差異。LGGs中的總T細胞還表達顯著增加的T細胞活化標記Ifn-γ水平(圖4B和4H)。與HGG和NT相比，T細胞共刺激分子Cd28和Th1轉錄因子Tbx21在LGG中也上調，但未達到統計學顯著性(圖4B和4H)。相比之下，HGG中的總T細胞表達的T細胞活化標志物(Cd69和Ifn-γ)和效應記憶標志物(Cd44)顯著少于LGG(圖4B和4H)。

CD4+ T細胞在LGG中表達的T細胞活化標志物Cd69明顯高于HGG (p < 0.05)。相比之下，CD4+ T細胞惡性進展為HGG后，T細胞抑制標志物Pdcd1、Lgals3、Lag3、Havcr2 (Tim3)、Th2轉錄因子(Gata3)和調節性T細胞(Treg)標志物(Foxp3)均出現增加(圖4C);然而，可能由于細胞計數非常低，沒有達到統計學意義。在CD8+ T細胞中，我們觀察到HGG中Cd28和Cd69的表達明顯低于LGG(圖4D)。總T細胞的IPA分析也發現了Th1極化和細胞毒性的抑制(圖4E)。IFNG和IRF3是HGG和LGG中下調最多的預測通路，而cite 2、IL-10RA和STAT6是HGG和LGG中上調最多的預測通路(圖4F)。接下來，我們使用X細胞對TCGA數據集進行反褶積分析，研究了LGG (n = 33)和HGG (n = 58)患者之間CD8 T細胞計數和自然殺傷細胞(NK)計數的差異(圖4G)。我們發現LGG患者的CD8+ T細胞和NK細胞富集評分顯著高于HGG患者，這與我們從RCAS-Ntva模型中得到的結果一致。

總之，我們在RCAS-Ntva模型中的結果以及在人類組織/數據集中的驗證支持，在腫瘤進展到HGG時，TME內的免疫抑制巨噬細胞簇可能限制了T細胞的功能和浸潤(圖4H)。

圖4攜帶HGG的動物T細胞活化受損

結論：

我們的數據表明，巨噬細胞在低級別腫瘤階段表現出免疫激活的特征，并在腫瘤轉化為高級別時獲得免疫抑制特征。在LGG和HGG之間的動態階段，針對巨噬細胞的功能研究可能消除免疫抑制機制，并為阻止惡性進展提供治療機會。

參考文獻

Rajendran S, Hu Y, Canella A, et al. Single-cell RNA sequencing reveals immunosuppressive myeloid cell diversity during malignant progression in a murine model of glioma. Cell Rep. 2023; 42(3):112197. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112197.