腎間質纖維化(RIF)是慢性腎臟疾病的常見病理表現。管狀上皮細胞的上皮-間充質轉化(EMT)被認為是RIF的主要原因。盡管lncRNAs被報道參與了各種病理生理過程，但lncRNA在RIF進展中的作用和潛在的分子機制尚不清楚。在本研究中，我們研究了lncRNA在RIF中的功能。微陣列分析顯示，TGF-b1和缺氧刺激使人腎近端小管細胞中lnc-CHAF1B-3的表達顯著上調，伴隨EMT相關基因的表達增加。敲低lnc-CHAF1B-3可顯著抑制TGF-b1誘導的I型膠原α 1、鈣粘蛋白-2、纖溶酶原激活物抑制物-1、SNAI1和SNAI2的上調表達。對IgA腎病患者石蠟包埋腎活檢樣本的qPCR分析顯示，lnc-CHAF1B-3表達與尿蛋白水平呈正相關，與估計的腎小球濾過率呈負相關。原位雜交結果顯示lnc-CHAF1B-3僅在近端小管表達。這些發現表明lnc-CHAF1B-3通過調節EMT相關信號來影響RIF的進展。因此，lnc-CHAF1B-3是治療RIF的潛在靶點。本文于2022年12月發表于“Molecular Therapy-Nucleic Acids”（IF=10.183）上。

技術路線

結果

1）TGF-b1刺激和缺氧上調lnc-CHAF1B-3的表達

為了鑒定與腎纖維化相關的lncRNA，lncRNA和mRNA微陣列分析使用了永生化人近端小管細胞(HK-2)和原代培養的人腎近端TECs (RPTECs)，這些細胞經TGF-b1 (10 ng/mL)處理或暴露于缺氧(1% O2)(圖1A)。基因集富集分析(GSEA)證實與TGF-b信號通路和缺氧相關的基因集，以及與EMT相關的基因在TGF-b1或缺氧處理的細胞中顯著富集(圖1B)。差異表達的lncRNA在圖1C的熱圖中顯示。共鑒定出21470個lncRNA。維恩圖顯示，5種lncRNA (lncCHAF1B-3, lnc-CHAF1B-2, MIR181A2HG, LOC100507487和LINC01638)普遍上調(圖1A，1D)。由于lnc-CHAF1B-3表達上調幅度較大，且目前尚無關于其功能的報道，我們決定進一步研究。

2）lnc-CHAF1B-3的敲除抑制了TGF-b1誘導的HK-2細胞反應

通過qRT-PCR分析，lnc-CHAF1B-3在TGF-b1處理的HK-2細胞中表達上調(圖2A)。與mRNA芯片結果一致，在TGF-b1處理的HK-2細胞中，COL1A1、CDH2、PAI-1、SNAI1和SNAI2的mRNA和蛋白水平也被證實顯著升高(圖2B、2C、2E-2I和2K-2N)。為了研究lncCHAF1B-3在腎近端小管細胞中的作用，我們使用了兩種不同的siRNAs和一種靶向lncCHAF1B-3的反義寡核苷酸(ASO)。siRNA #1在對照組和TGF-b1處理的HK-2細胞中均顯著下調lnc-CHAF1B-3的表達(圖2A)。同時，與siRNA轉染的對照細胞相比，轉染siRNA #1的細胞經TGF-b1處理后COL1A1、CDH2、PAI-1、SNAI1和SNAI2 mRNA和蛋白水平的上調被顯著抑制(圖2B、2C、2E-2I和2K-2N)。在波形蛋白(VIM)方面，雖然通過敲除lnc-CHAF1B-3，TGF-b1誘導的VIM mRNA表達顯著降低，但蛋白水平未見明顯變化(圖2D、2J、2N)。此外，我們還進行了RNA測序(RNA-seq)實驗。GSEA表明，在TGF-b1刺激的HK-2細胞中，siRNA #1和siRNA #2敲除lnc-CHAF1B-3顯著降低了與EMT、TGF-b信號和缺氧相關的基因集。此外，每種siRNA顯著改變的前20個基因集中，有14個基因集是常見的(圖3)。為了確定lnc-CHAF1B-3是否也參與炎癥信號，我們用TNF-a刺激HK-2細胞。在TNF-a處理的HK-2細胞中，CDH1的mRNA水平被顯著抑制。然而，TNF-a刺激并沒有增加lnc-CHAF1B-3和EMT相關基因的表達(圖2O)。這些結果表明lnc-CHAF1B-3參與了TGF-b1誘導的EMT程序。

3）Lnc-CHAF1B-3敲除抑制TGF-b1誘導的RPTECs反應

為了進一步探索lnc-CHAF1B-3在腎近端小管細胞中的作用，我們對RPTECs進行了類似的實驗。與對照細胞相比，TGF-b1處理的RPTECs中 lnc-CHAF1B-3表達顯著增加(圖4A)。在TGF-b1處理的RPTECs中，COL1A1、CDH2、PAI-1和SNAI1的mRNA和蛋白水平也顯著升高(圖4B、4D-4G和4I - 4L)。而敲除lnc-CHAF1B-3后，COL1A1、PAI-1和SNAI1 mRNA和蛋白的表達顯著降低(圖4B、4E-G和4J-4L)。TGF-b1處理后CDH1蛋白水平明顯下降，但lnc-CHAF1B-3敲除后恢復(圖4H和4L)。這些結果表明lnc-CHAF1B-3參與了腎TECs中的EMT相關信號通路，并可能在腎纖維化的發展中發揮重要作用。

4）IgA腎病患者腎活檢組織中lnc-CHAF1B-3的表達

為了進一步探討lnc-CHAF1B-3在人類腎臟疾病中的作用，我們對IgA腎病患者的腎臟標本進行了回顧性分析。如圖5A所示，通過qRT-PCR檢測發現lnc-CHAF1B-3在晚期病例中的表達明顯高于輕癥病例。作為健康對照組的替代，我們還評估了3例病理診斷為輕度腎小球異常(MGAs)患者的腎臟標本，這些患者的腎功能相對保留，尿蛋白輕度與輕度IgA腎病相似(圖5A)。結果發現MGA患者中lnc-CHAF1B-3的表達明顯低于晚期IgA腎病患者。IgA腎病患者腎臟lnc-CHAF1B-3表達與血清肌酐(Cre)、尿蛋白水平、間質纖維化和腎小管萎縮(IF/TA)顯著正相關。然而，lnc-CHAF1B-3的表達與尿紅細胞之間未觀察到顯著相關(圖5B-5E)，但在估計的腎小球濾過率(eGFR)與lnc-CHAF1B-3的表達之間觀察到顯著負相關(圖5F)。此外，根據eGFR臨界值60 mL/min/1.73 m2（定義為CKD），將所有病例分為eGFR保存組和受損組，受損組lnc-CHAF1B-3的表達水平明顯高于eGFR保留組(圖5G)。

5）lnc-CHAF1B-3在近端小管表達

為了研究lnc-CHAF1B-3在病變人類腎臟中的定位和作用，對腎活檢標本進行lnc-CHAF1B-3多重免疫熒光標記。lnc-CHAF1B-3(綠色)和CD10(紅色，圖6A)、EMA(藍色，圖6B)或DAPI(藍色，圖6C)的雙標記顯示，在近端小管的細胞質中觀察到lncCHAF1B-3。

結論：

本研究報道lnc-CHAF1B-3在腎纖維化的發展中起重要作用。lnc-CHAF1B-3可能是治療腎纖維化的潛在靶點。

參考文獻：

Imai K, Ishimoto T, Doke T, Tsuboi T, Watanabe Y, Katsushima K, Suzuki M, Oishi H, Furuhashi K, Ito Y, Kondo Y, Maruyama S. Long non-coding RNA lnc-CHAF1B-3 promotes renal interstitial fibrosis by regulating EMT-related genes in renal proximal tubular cells. MolTher Nucleic Acids. 2022 Dec 23;31:139-150. doi: 10.1016/j.omtn.2022.12.011.