膠質瘤是最常見的惡性原發性腦腫瘤，具有高度免疫抑制腫瘤微環境(TME)，預后差。環狀RNAs (circRNA)是一種新發現的內源性非編碼RNA，具有高穩定性、豐度、保持性等特點，在多種腫瘤的病理生理過程和TME重構中發揮重要作用。circNEIL3可被EWS RNA結合蛋白1(EWSR1)環化，在膠質瘤組織中上調，并與膠質瘤惡性進展呈正相關。功能上，circNEIL3在體內和體外促進膠質瘤的發生和癌變進程。機制上，circNEIL3通過阻止HECTD4介導的泛素化來穩定IGF2BP3蛋白(一種已知的致癌蛋白)。circNEIL3過表達膠質瘤細胞驅動巨噬細胞浸潤到腫瘤微環境(TME)。circNEIL3被hnRNPA2B1包裝成外泌體，并傳遞給浸潤的腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)，使它們通過穩定IGF2BP3獲得免疫抑制特性，進而促進膠質瘤的進展。本文揭示了circNEIL3在促進膠質瘤發生、惡性進展和巨噬細胞腫瘤促進表型極化方面發揮著顯著作用，突出了circNEIL3是膠質瘤潛在的預后生物標志物和治療靶點。本文于2022年1月發表于Molecular Cancer (IF=41.444)上。

技術路線:

主要研究結果：

(1) circNEIL3在膠質瘤組織中顯著上調

為了鑒定參與膠質瘤發生和發展的潛在致癌circRNAs，我們利用RNA測序(RNA-seq)分析了39個膠質瘤組織和8個正常腦組織(NBTs)中circRNAs的表達譜。火山圖顯示，在GBM和LGG之間以及LGG和NBTs之間，circRNA表達存在系統性差異(圖1A,B)。我們進一步分析了膠質瘤組織中差異上調的circRNAs，并鑒定出hsa_circ_0001460，這是唯一一種隨著膠質瘤分級升高而上調的circRNAs(圖1C)。將hsa_circ_0001460命名為circNEIL3，它是從NEIL3生成的。與NBTs相比，circNEIL3在膠質瘤組織中明顯上調且其表達隨著膠質瘤級別的升高而升高(圖1D)。采用ROC曲線評估circNEIL3對膠質瘤分級的診斷效果，曲線下面積AUC為0.719，表明circNEIL3可以預測膠質瘤患者預后不良(圖1E)。

circNEIL3后剪接在NEIL3基因的第8外顯子和第9外顯子之間，長度為596 nt(圖1F)。使用發散引物擴增circNEIL3的后剪接結位點，并通過Sanger測序確認(圖1F)。我們設計了發散型和收斂型引物來擴增circNEIL3及其線性形式。RT-qPCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析結果顯示，circNEIL3只能從cDNA中擴增，而其線性形式可以從cDNA和gDNA中擴增(圖1G)。我們通過RNase R和放線菌素D的處理，證實circNEIL3比NEIL3更穩定(圖1H,I)。circRNAs的功能主要與其在細胞內的定位有關。然后我們進行了核細胞質分離實驗和FISH分析。circNEIL3主要定位于細胞質(圖1J,K)。這些結果表明，circNEIL3在膠質瘤組織中顯著上調，且在GBM中表達量最高，提示其參與了膠質瘤的發生和惡性進展。

圖1：circRNA在膠質瘤中的表達譜及circNEIL3的鑒定

(2)circNEIL3在體外和體內均促進膠質瘤的發生

為了研究circNEIL3在膠質瘤進展中的潛在生物學作用，我們根據轉錄組測序數據，對與circNEIL3表達顯著正相關的基因進行KEGG富集分析。為了探索這些不同circNEIL3表達樣本之間的生物學行為，我們使用單樣本GSEA (ssGSEA)算法來估計每個樣本的通路富集分數。

由于circNEIL3可能參與細胞增殖、侵襲和遷移，我們進一步研究了circNEIL3在細胞行為中的功能。我們證實下調circNEIL3顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲。過表達circNEIL3在體外顯著促進了這些細胞行為(圖2A-D)。體內實驗表明，下調circNEIL3可顯著抑制腫瘤生長和侵襲性，延長荷瘤小鼠的生存期，而過表達circNEIL3則具有相反的作用(圖2E,F)。切除的腫瘤切片免疫組化(IHC)顯示，circNEIL3敲除的腫瘤組織中Ki67(一種增殖標志物)和CD44(一種侵襲標志物)的表達低于載體組，而circNEIL3過表達則相反(圖2G)。這些數據表明circNEIL3在調節腫瘤發生和膠質瘤進展中具有重要的功能。

圖2：circNEIL3在體內外促進GBM細胞增殖和轉移

(3)EWSR1在膠質瘤中促進circNEIL3的生物發生

circRNAs的環化機制是由RNA結合蛋白(RBPs)結合到pre-mRNA的上游和下游區域來調控的。我們利用CircInteractome數據庫預測了EWSR1在circNEIL3的上游和下游區域的三個結合位點，分別為序列1、序列2和序列3(圖3A)。EWSR1的表達水平隨著膠質瘤的分級而升高，高表達的患者預后比低表達的患者差(圖3B)。我們驗證了敲除EWSR1可以抑制GBM細胞的增殖、侵襲和遷移(圖3C,D)。在我們自己的數據庫中，circNEIL3與EWSR1正相關(圖3E)，并且在EWSR下調的U251和A172細胞中circNEIL3的表達明顯死亡(圖3F)。最近的一項研究表明，EWSR1在缺氧環境中可能更活躍。因此，我們將U251和A172細胞置于缺氧條件下0 h、6 h、12 h和24 h, EWSR1和circNEIL3的表達隨著暴露時間的增加而上調(圖3G,H)。RIP-qPCR檢測證實EWSR1可與NEIL3 pre-mRNA序列1和序列3結合，且在缺氧條件下結合能力明顯上調(圖3I)。為了進一步證實觀察到的EWSR1介導的表型是由circNEIL3表達失調促進的，我們進行了功能挽救實驗。如圖3J-L所示，EWSR1過表達可引起U251和A172細胞增殖、遷移和侵襲的增加，而下調circNEIL3可逆轉這一趨勢。這些數據表明，circNEIL3可以被EWSR1環化，并且這個過程在缺氧條件下更活躍。

圖3：EWSR1促進circNEIL3的生物發生

(4)circNEIL3與IGF2BP3物理相互作用，抑制泛素/蛋白酶體介導的IGF2BP3降解

為了探索circNEIL3誘導GBM細胞進展的分子機制，我們進行了RNA下拉實驗和質譜實驗探索與circNEIL3結合的潛在蛋白質。circNEIL3與IGF2BP3蛋白結合(圖4A)。RNA下拉和RIP-qPCR證實了circNEIL3與IGF2BP3之間的相互作用(圖4B,C)。RNA FISH-免疫熒光(FISH-IF)分析表明circNEIL3與IGF2BP3在細胞質中共定位(圖4D)。我們建立了6個FLAG標記載體，并通過Western Blot檢測哪些結構域與circNEIL3相互作用(圖4E,F)。RIP-qPCR顯示，circNEIL3主要結合在KH3-4區域，這表明KH3-4雙結構域負責招募circNEIL3(圖4G)。然后我們在circNEIL3中尋找IGF2BP3募集所必需的基序。我們設計了三個突變位點，IGF2BP3與circNEIL3的第三個位點結合(圖4H)。這些結果表明circNEIL3在細胞質中與IGF2BP3發生物理相互作用。

circNEIL3沒有顯著改變IGF2BP3的mRNA水平(圖4I)，但顯著促進了其蛋白表達及其下游靶點的表達，包括CDK4/6、CD44和c-MYC(圖4J)，這些靶點參與細胞增殖、侵襲和遷移的生物學功能。circNEIL3過表達增強了IGF2BP3蛋白的表達水平，延長了IGF2BP3的半衰期(圖4K)。circNEIL3過表達降低了IGF2BP3的泛素化(圖4L)。我們僅鑒定出一個位于IGF2BP3的KH3結構域的泛素化賴氨酸(K)殘基(K450)(圖4N)。使用uniport數據庫預測IGF2BP3的K450位點在6個物種中高度保守(圖4N)。我們預測了IGF2BP3的結構，并可視化K450泛素化位點(圖4O)。免疫共淀(IP)顯示，與WT IGF2BP3相比，K450突變顯著降低了IGF2BP3的泛素化水平，并且在表達該突變體的細胞中，circNEIL3過表達導致的泛素化增強也被抑制(圖4M)，表明K450是IGF2BP3的主要泛素化位點。因此circNEIL3通過抑制泛素/蛋白酶體依賴性降解，增強了IGF2BP3蛋白的穩定性，從而促進膠質瘤的惡性進展。

圖4：circNEIL3與IGF2BP3發生物理相互作用并抑制其泛素化

(5)circNEIL3通過阻止HECTD4介導的泛素化來穩定IGF2BP3蛋白

TRIM25在NSCLC中介導IGF2BPs的泛素化。然而目前尚無E3泛素連接酶介導膠質瘤IGF2BP3泛素化的報道。因此，我們試圖鑒定E3連接酶參與膠質瘤中蛋白酶體介導的IGF2BP3降解。我們在體外驗證了HECTD4可以抑制GBM細胞的增殖、侵襲和遷移(圖5A,B)。我們進行了免疫熒光(IF)實驗，證實IGF2BP3與HECTD4在細胞質中共定位(圖5C)。在HECTD4敲低的GBM細胞中，IGF2BP3蛋白水平顯著升高(圖5D)，而其泛素化水平明顯降低(圖5E)，這表明在膠質瘤中，HECTD4作為E3泛素連接酶，通過泛素-蛋白酶體途徑降解IGF2BP3。

對circNEIL3的質譜分析顯示，circNEIL3沒有與HECTD4結合，但過表達的circNEIL3可以阻斷IGF2BP3與HECTD4的結合(圖5F)，這解釋了circNEIL3如何穩定IGF2BP3。為了進一步證實circNEIL3可以抑制IGF2BP3與赫克特4的結合，我們進行了Co-IP實驗，HECTD4與IGF2BP3的KH3-4結構域結合，這是circNEIL3與IGF2BP3相互作用的同一位點(圖5G, 4G)。這些數據表明circNEIL3通過空間位阻阻斷了IGF2BP3與HECTD4的結合，最終抑制了IGF2BP3的泛素化?？傊?，circNEIL3通過阻止HECTD4介導的泛素化來穩定IGF2BP3蛋白。

圖5：circNEIL3阻斷了IGF2BP3和HECTD4的結合

(6)circNEIL3促進膠質瘤巨噬細胞浸潤

為了探討circNEIL3表達不同的膠質瘤樣本之間生物學行為的差異，我們根據circNEIL3的中位表達將膠質瘤樣本分為高表達組和低表達組。采用Deseq2包進行差異表達分析，高表達組與circNEIL3低表達組共有801個基因存在差異表達；531個基因上調，270個基因下調。

為進一步了解circNEIL3在膠質瘤免疫表型中的確切作用，使用ESTIMATE算法評估了膠質瘤純度、基質和免疫評分。如圖6A所示，circNEIL3高表達組較circNEIL3低表達組細胞浸潤TME較多，免疫和間質評分較高，腫瘤純度較低。與低circNEIL3表達的膠質瘤相比，高circNEIL3表達的膠質瘤巨噬細胞浸潤明顯增加，巨噬細胞構成了膠質瘤TME中最豐富的細胞群。circNEIL3高表達膠質瘤中TAM BMDM(以下簡稱巨噬細胞)浸潤明顯增加，TAM MGs數量有所減少(圖6A)。Transwell實驗表明，與NC組相比，來自circNEIL3過表達的GBM細胞的條件培養基(CM)顯著促進了THP1分化的巨噬細胞遷移(圖6B)，而來自circNEIL3低表達的GBM細胞的條件培養基(CM)顯示相反的結果(圖6C)。circNEIL3過表達的腫瘤細胞可以驅動巨噬細胞浸潤到膠質瘤微環境中。

接下來，我們探討了circNEIl3促進巨噬細胞募集的潛在調控機制。GSEA結果表明，與circNEIL3-low樣本相比，高circNEIL3樣本中YAP1信號信號基因簽名高度富集(圖6D)。對TCGA膠質瘤樣本中IGF2BP3的評估也顯示了相同的結果(圖6E)。qRT-PCR驗證了circNEIL3促進CCL2和LOX表達的結果(圖6F)，而這種由circNEIL3過表達引起的表達增強可以通過下調IGF2BP3來挽救(圖6G)。circNEIL3可以增加GBM細胞中YAP1和LOX的蛋白表達(圖6H)。circNEIL3過表達引起的表達增加也可以通過敲低IGF2BP3來消除(圖6I)?？傊?，circNEIL3過表達的GBM細胞可能通過激活YAP1信號通路來驅動巨噬細胞浸潤到腫瘤相關微環境中。

圖6：circNEIL3在膠質瘤中促進巨噬細胞浸潤

(7) circNEIL3可以被hnRNPA2B1包裝成外泌體

circRNAs可以被包裝成外泌體，并在腫瘤的進展中發揮重要作用。在中性鞘磷脂酶-2 (nSMase)藥理抑制劑GW4869處理的細胞中，circNEIL3的表達下調，阻斷了外泌體的形成(補充圖未展示)，從而證實了circNEIL3在外泌體中存在。這些結果表明circNEIL3可以被包裝到外泌體中。

接下來，我們研究了circNEIL3被包裝到外泌體中的機制。我們在GBM細胞中通過RIP和RNA下拉實驗證實了circNEIL3和hnRNPA2B1之間的相互作用(圖7A,B)。在hnRNPA2B1敲除的GBM細胞中，circNEIL3在細胞中表達上調，在外泌體中表達下調(圖7C)。這些結果表明circNEIL3可以被hnRNPA2B1包裝成外泌體。

圖7：外泌體可以將circNEIL3傳遞給TAMs，從而使它們獲得血管生成和免疫抑制特性

(8)外泌體將circNEIL3傳遞給TAMs，從而使它們通過穩定IGF2BP3獲得免疫抑制特性

流式細胞術結果顯示circNEIL3過表達顯著上調巨噬細胞活化標志物CD163(圖7D)。circNEIL3過表達顯著上調了維持膠質瘤細胞存活并刺激血管生成的SPP1蛋白表達。我們假設外泌體可以將circNEIL3傳遞到巨噬細胞，從而調節巨噬細胞的免疫抑制表型。隨著circNEIL3在外泌體中的表達增加，巨噬細胞激活標志物、免疫抑制分子和SPP1顯著上調(圖7E,F)。這些結果表明，外泌體可以將circNEIL3傳遞給TAMs，從而使它們獲得血管生成和免疫抑制特性。

為了闡明circNEIL3介導巨噬細胞免疫抑制特性的機制，進行了RNA下拉和RIP實驗，在THP1分化的巨噬細胞中，circNEIL3與IGF2BP3結合的位置與腫瘤細胞中相同(圖7G,H)。在腫瘤細胞中，circNEIL3增加了分化的THP1巨噬細胞中IGF2BP3蛋白的表達并抑制了IGF2BP3的泛素化(圖7I,J)。Western Blot證實，在THP1分化的巨噬細胞中，過表達circNEIL3和IGF2BP3均能增強YAP1蛋白的表達，而敲除它們則相反(圖7K,L)。過表達circNEIL3所引起的YAP1蛋白表達增強可被敲除IGFB2P3所消除(圖7M)，提示circNEIL3通過穩定IGF2BP3蛋白來增強YAP1的表達。這反過來促進了巨噬細胞的免疫抑制表型極化。

為進一步驗證circNEIL3在體內對巨噬細胞免疫抑制極化的作用，將過表達cicrNEIL3的巨噬細胞或陰性對照載體與膠質瘤細胞原位共植入裸鼠大腦。與NC組相比，circNEIL3過表達組腫瘤生長升高，荷瘤小鼠生存期延長(圖7N-P)。IGF2BP3可以作為circNEIL3在巨噬細胞中的下游效應子，使其獲得免疫抑制特性，從而促進膠質瘤的進展。

結論：

一種新的環狀RNAcircNEIL3在膠質瘤組織中上調。circNEIL3的表達隨著膠質瘤分級的增加而增加，而circNEIL3可受EWSR1的調控。功能上，circNEIL3在體外和體內促進了膠質瘤的發生和進展。機制上，circNEIL3通過阻止HECTD4介導的泛素化來穩定IGF2BP3。過表達circNEIL3的膠質瘤細胞可促使巨噬細胞浸潤TME。circNEIL3可以被hnRNPA2B1包裝成外泌體并傳遞給浸潤的TAMs，從而使它們通過穩定IGF2BP3獲得免疫抑制特性，進而促進膠質瘤的發生和惡性進展。circNEIL3是一種新的預后生物標志物和有前途的膠質瘤治療靶點。

參考文獻：

Pan, Z., Zhao, R., Li, B., Qi, Y., Qiu, W., Guo, Q., Zhang, S., Zhao, S., Xu, H., Li, M., Gao, Z., Fan, Y., Xu, J., Wang, H., Wang, S., Qiu, J., Wang, Q., Guo, X., Deng, L., Zhang, P., … Li, G. (2022). EWSR1-induced circNEIL3 promotes glioma progression and exosome-mediated macrophage immunosuppressive polarization via stabilizing IGF2BP3. Molecular cancer, 21(1), 16. https://doi.org/10.1186/s12943-021-01485-6.