新生米色脂肪細胞的生物發生涉及白色脂肪組織(WAT)中祖細胞的增殖;然而,是什么調控了這一過程仍不清楚。在這里,本演技報告了在小鼠模型和人類組織中,WAT脂解衍生的亞油酸在冷適應、b3-AR激活和燒傷后觸發米色祖細胞增殖。細胞表面標記物PDGFRa或Sca1和CD81標記的脂肪祖細胞亞群含有豐富的嵴線粒體,并通過脂肪酸轉運蛋白CD36主動輸入亞油酸。口服補充亞油酸,即使在熱中性條件下以CD36依賴的方式刺激米色祖細胞增殖。總之,本研究結果為多樣化的病理生理提供機制性的見解。本研究于2022年12月發表于期刊《Developmental cell》上,IF:1.417。
技術路線:
主要研究結果:
作者建立在他莫昔芬處理后的CD81 +細胞中選擇性缺乏脂肪生成主要調節因子PPARg的小鼠。為此,作者在PpargCD81 KO小鼠中建立了他莫昔芬治療后在CD81 +細胞中選擇性缺乏脂肪生成的主要調節因子PPARg的小鼠(圖1A)。小鼠在30℃下接受他莫昔芬治療,隨后適應8℃。冷刺激下,對照組小鼠(Ppargflox/flox)在腹股溝WAT(白色脂肪組織)的前、中、后區有大量表達UCP1(解偶聯蛋白1)的多室脂肪細胞簇,這是米色脂肪細胞的一個形態學特征(圖1B)。相比之下,PpargCD81 KO小鼠腹股溝WAT在冷刺激下白色脂肪組織大大受損(圖1B)。與形態學變化一致,PpargCD81 KO小鼠腹股溝WAT中棕色/米色脂肪選擇基因UCP1、Pgc1a、Cidea和Elovl3的表達水平明顯低于對照組小鼠(圖1C)。這些結果說明大量冷刺激誘導下的白色脂肪組織起源于小鼠腹股溝WATCD81+祖細胞(APC)。作者發現腹股溝WAT中CD81 +APC(Lin- : Sca1 + : CD81 + : Ki67 +)在冷暴露3天內Ki67 +細胞群數量顯著增加(圖1D)。用CD81-lineage reporter小鼠進行組織學分析也表明腹股溝WAT的基質細胞共表達GFP和Ki67,Ki67+ GFP+細胞的數量在冷刺激下顯著增長(圖1E-F)。除了冷刺激,用b3-AR治療3天,相較于載體處理小鼠WAT,治療后小鼠腹股溝WAT中Ki67+和CD81+細胞增多(圖1G)。FACS(熒光激活細胞分選術)定量地檢測來自活檢組織Lin svf中Ki67+和CD81+細胞的數量,發現CL316,243在體外培養的小鼠腹股溝WAT中以劑量依賴的方式顯著增加Ki67+和CD81+細胞的數量(圖1I)。在人WAT中b3-AR治療也顯著增加Ki67+和CD81+細胞的數量,盡管處于非刺激下的Ki67+和CD81+細胞數量與個體之間的有所不同(圖1J)。
根據在小鼠中建立的方案,在燒傷和假手術處理后,作者將獲得腹股溝WAT 1天、3天和7天的C57BL/6J小鼠(圖2A)。燒傷后3天和7天血漿游離脂肪酸(FAA)水平明顯高于對照組小鼠(圖2B)。燒傷后7天,受傷小鼠腹股溝WAT各區域均有大量多房型米色脂肪細胞,其中大部分表達UCP1蛋白(圖2C)。與對照組小鼠相比,在燒傷后7天,形態變化伴隨著棕/米色選擇基因的表達增加,如Ucp1、Elovl3、Dio2和Cox8b(圖2D)。重要的是,作者發現在燒傷3天和7天后,小鼠腹股溝WAT中Ki67+CD81+細胞顯著增多(圖2E-F)。這些結果表明米色脂肪發生的病理刺激包括WAT中CD81+祖細胞的增殖。
圖2 燒傷促進CD81+ APC細胞增殖
3、脂肪分解是米色脂肪細胞增殖所必需的
為驗證猜想WAT脂肪多聚物衍生因子介導米色祖細胞的增殖,作者使用缺乏脂肪肝三酯脂肪酶(ATGL)小鼠,即Adipo-ATGL KO小鼠。在這個實驗中,Adipo-ATGL KO小鼠和它的同窩出生的小鼠在30℃下生存14天,隨后8℃下生存3天(圖3A-B)。
冷馴化3天后,對照組小鼠腹溝WAT庫的組織學分析發現大量米黃色脂肪細胞,多房脂質和UCP1表達,特別是在中間區域。相反,在AdipoATGL KO小鼠中,冷誘導的米色脂肪細胞的生物生成幾乎完全消失(圖3C)。此外,adipocyte-specificATGL缺失顯著降低了在腹股溝WAT中棕色/米色脂肪選擇基因的表達,包括Ucp1、Pgc1a、Cidea、Dio2、Cox8b和Prdm16(圖3D)。
接著FACS檢測30C和冷馴化后小鼠腹股溝WAT中CD81+細胞的增殖。30℃時,Ki67+ CD81+細胞數量在基因型間無差異。冷馴化顯著增加對照組小鼠Ki67+ CD81+細胞數量;然而,這種冷誘導的米色祖細胞增殖在Adipo-ATGL KO小鼠中完全消失(圖3E)。當CL316243處理體外培養的腹股溝WAT時,觀察到對照小鼠來源的WAT庫中的CD81+ Ki67+細胞的數量顯著增加。相比之下,CL316243在AdipoATGL KO小鼠中的刺激作用減弱(圖3F)。與遺傳學研究一致的是,Atglistatin對ATGL的藥理抑制有效的阻斷CL316243對野生型小鼠腹股溝WAT中CD81+細胞增殖的刺激(圖3G)。
圖3 CD81+ APC細胞增殖需要脂解作用
4、亞油酸刺激米色脂肪祖細胞增殖
作者下面鑒定脂質分解因素介導的米色脂肪細胞增殖(圖4A)。煮沸培養基中的脂質提取物能夠刺激CD81+細胞增殖(圖4B)。隨后,作者基于前人的數據庫和質譜循環分析證明了冷刺激和b3-AR治療都能持續的增加,如圖4C所示的6種脂肪酸。補充亞油酸顯著刺激CD81+細胞的增殖,而其他細胞沒有明顯變化(圖4D)。亞油酸處理通過增加S期和G2-M期細胞數量促進細胞增殖,CD81+細胞優先增殖(圖4E)。同時,作者也發現是亞油酸,而不是a亞麻酸或反亞麻酸,亞油酸的幾何異構體促進CD81+細胞增殖(圖4F)。為檢測口服亞油酸是否促進體內米色細胞增殖,野生型雄性小鼠在30℃條件下,每天攝入濃度為1%的亞油酸(圖4G)。FACS檢測發現口服亞油酸可使小鼠體內Ki67+ CD81+細胞顯著增加3倍(圖4H)。盡管8℃的冷刺激會促使處理過的小鼠米色脂肪的生物生成,但是補充亞油酸進一步促進小鼠米色脂肪的生物生成(圖4I)。作者發現補充亞油酸增強腹股溝WAT中CD81+細胞米色脂肪的生成(圖4J)。作者發現補充亞油酸可以有效刺激對照組中小鼠腹股溝WAT中米色脂肪的生成,而在PpargCD81 KO小鼠中這種作用明顯減弱(圖4K)。與分子分析一致的是,腹股溝WAT的組織學分析顯示PpargCD81KO小鼠的多房米色脂肪細胞比對照組少(圖4L)。這些結果表明,當補充亞油酸和冷刺激結合時,增強CD81+細胞來源的新生米色脂肪的生物生成。
圖4 亞油酸刺激CD81+APC增殖
5、米色脂肪祖細胞中活躍的線粒體代謝和花生四烯酸通路
為探索亞油酸刺激米色祖細胞增的機制,作者對腹股溝WAT中原生CD81+和CD81-細胞進行RNA測序。與之前的分析一致,轉錄組學分析顯示,與CD81-細胞相比,CD81+細胞表達出高水平的平滑肌基因富集,包括Acta2、Sm22和Myh11(圖5A)。值得注意的是,CD81+細胞表達的線粒體編碼基因,如Atp6、Atp8、Cox1、Cox2和Cytb,明顯高于來自腹股溝WAT的CD81-細胞(圖5A)。電子顯微鏡(EM)中發現CD81+細胞中含有大量的線粒體,其中許多線粒體呈球形或橢圓形,并平行于致密嵴,表現出棕色前脂肪細胞的形態學特征(圖5B)。此外,CD81+細胞的耗氧率明顯高于基礎狀態和羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)處理后的CD81細胞(圖5C)。補充亞油酸通過增強FA氧化進一步激活CD81 +細胞的生物能量學,因為肉堿棕櫚酰轉移酶(CPT)抑制劑(乙莫克害)抑制FA氧化減弱亞油酸對細胞呼吸的刺激作用(圖5D)。
從轉錄組數據中發現CD81+細胞與CD81細胞相比,花生四烯酸合成途徑高度富集(圖5E)。接下來,脂質組學檢測暴露8℃ 3天的小鼠原代CD81+和CD81-細胞中前列腺素的水平。分析發現PGD2在CD81+細胞中的水平顯著高于CD81-細胞(圖5F)。隨后,液相色譜-串聯質譜法(LC-MS / MS)定量CD81+細胞中PGD2的含量以及釋放到培養基中的PGD2水平,發現抑制Cox2顯著降低PGD2的細胞水平和釋放水平(圖5G),表明Cox2是CD81+細胞合成PGD2所必需的。Cox1、Alox5和Alox12的抑制劑不干擾亞油酸的作用(圖5H)。其次,鑒于CD81+細胞表達高水平的前列腺素受體,如DP1,作者確定PGD2直接作用于米色祖細胞的程度。另外還發現PGD2可以顯著促進CD81+細胞的增殖,而DP1的特異性抑制劑MK-0524可以阻斷PGD2的促增殖作用(圖5I)。冷暴露顯著增加腹股溝WAT中Ki67 + CD81 +細胞的數量;然而,Cox2抑制劑處理顯著減弱冷暴露對CD81 +祖細胞增殖的刺激作用(圖5J)。這些結果表明脂解衍生的亞油酸被線粒體中的CD81 +祖細胞氧化,并通過Cox2途徑用于PGD2的合成。
圖5 CD81+在線粒體代謝和花生四烯酸途徑中富集
為解決米色祖細胞如何攝取亞油酸,作者首先在腹股溝WAT中尋找CD81+米色祖細胞相對于CD81-細胞高表達的細胞膜蛋白。轉錄組學數據鑒定出多個候選基因,包括Slc7a2(或稱為Cat2)、Tmem37和Cd36(圖6A)。
作者用qPCR(圖6B)和CD36抗體(圖6C)在獨立樣本中驗證CD36與CD81、整合素b1或b2和SRC家族激酶類形成異源復合物,驅動CD36的內化。。接著,作者通過選擇性敲除CD81+細胞(Cd81-CreERT2Cd36flox / flox小鼠,Cd36CD81 KO小鼠)中的CD36來驗證CD36介導米色祖細胞攝取亞油酸的假說。Cd36CD81 KO小鼠和同窩對照在30℃下用他莫昔芬處理,然后逐漸適應8℃3天(圖6D-E)。冷暴露3天后,發現Cd36CD81 KO小鼠腹股溝WAT中Ki67+ CD81 +細胞數量顯著低于對照小鼠45 %(圖6F-G)。組織學分析顯示,與對照小鼠相比,Cd36CD81 KO小鼠腹股溝WAT中含有更少的多房UCP1 +米色脂肪細胞(圖6H)。然而,由于Cd36CD81 KO小鼠腹股溝WAT中棕色/米色脂肪選擇性基因的表達水平低于對照組(圖6I),因此CD36缺失導致的米色脂肪生物合成受損是顯著的。
在沒有任何刺激的情況下,對照組和Cd36CD81 KO來源的CD81+細胞的增殖沒有差異。然而,亞油酸誘導的Cd36CD81 KO小鼠CD81+細胞增殖明顯減弱(圖6J)。補充亞油酸后,Cd36CD81 KO小鼠腹股溝WAT中Ki67 + CD81 +細胞數量低于對照組小鼠(圖6K)。在Cd36CD81 KO小鼠中,CD81 +細胞增殖減弱導致米色脂肪生物合成受損,因為冷和亞油酸補充對米色脂肪生物合成的加和作用被削弱(圖6L)。此外,與對照組小鼠相比,Cd36CD81KO小鼠腹股溝WAT部位含有較少的多房米色脂肪細胞(圖6M)。最后得出結論,病理生理棕色化刺激、冷習服、b3 - AR激活和燒傷促進米色脂肪新生(圖7)。
圖6 CD36是CD81+ APC增殖所必需的
圖7米色脂肪生物生成的模型
參考文獻:
Abe I, Oguri Y, Verkerke ARP, Monteiro LB, Knuth CM, Auger C, Qiu Y, Westcott GP, Cinti S, Shinoda K, Jeschke MG, Kajimura S. (2022). Lipolysis-derived linoleic acid drives beige fat progenitor cell proliferation. Dev Cell;57(23):2623-2637.e8. doi: 10.1016/j.devcel.2022.11.007.