實體腫瘤在細胞死亡和增殖之間表現(xiàn)出動態(tài)平衡，確保腫瘤持續(xù)生長。越來越多的證據(jù)將增強的癌細胞凋亡與腫瘤微環(huán)境中細胞的旁分泌激活聯(lián)系起來，然而，死亡的癌細胞對鄰近腫瘤上皮細胞的直接影響以及這種旁分泌效應如何潛在地導致治療耐藥性尚不清楚。在這里，我們證明了在患者來源的結直腸腫瘤類器官中，化療誘導的腫瘤細胞死亡會導致ATP釋放，觸發(fā)P2X4，從而介導鄰近癌細胞中mTOR依賴的前生存程序，從而使存活的腫瘤上皮細胞對mTOR抑制敏感。持久上皮細胞中誘導的mTOR依賴是由于活性氧的產(chǎn)生增加以及隨后對鄰近細胞死亡的DNA損傷增加。因此，抑制P2X4受體或直接mTOR阻斷可阻止S6磷酸化的誘導，并與化療協(xié)同，導致活性氧誘導的大量細胞死亡和單獨應用時未見的顯著腫瘤消退。相反，清除活性氧可以防止癌細胞依賴mTOR激活?？偟膩碚f，我們的研究結果表明，死亡的癌細胞在其存活的鄰居中建立了對抗凋亡程序的新依賴，從而為表達P2X4的上皮腫瘤的聯(lián)合治療創(chuàng)造了機會。本文于2022年11月發(fā)表于“Nature”（IF=69.504）上。

技術路線

結果

1）hCRC PDTOs對5-FU的抗性依賴于mTOR的激活

為了研究腫瘤細胞死亡對鄰近上皮細胞的可能影響，并評估這種旁分泌效應是否可能導致治療耐藥性，我們使用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理來自人類結直腸癌(hCRC)的患者來源的腫瘤類器官(PDTO)。在4小時內(nèi)，可以觀察到明顯的細胞死亡(圖1a,b)。為了確定在存活的類器官中哪些信號通路可能被激活以響應5-FU誘導的細胞死亡，我們使用磷酸激酶陣列來分析激酶活性。p70 S6激酶(T389和T421/S424)以及PRAS40(T246)的磷酸化增強(圖1c)，這兩種激酶參與了mTORC1的調(diào)節(jié)。免疫印跡分析證實，在5-FU給藥后4小時開始檢測到細胞死亡時，S6核糖體蛋白磷酸化升高，從而激活了p70 S6激酶、PRAS40和mTOR(圖1d)。為了證實這些激酶的激活是5-FU誘導的細胞死亡的結果，我們添加了zVAD和necrostatin-1來阻止細胞凋亡和壞死，這完全阻止了p70 (p-p70) S6激酶、p-PRAS40和p-S6在4小時的磷酸化誘導(圖1e)。然后，我們研究了誘導的mTOR激活是否有助于PDTO對5-FU的抗性，并使用5-FU、雷帕霉素或兩者的組合治療PDTO。盡管單獨處理的效果不大，但5-FU和雷帕霉素聯(lián)合施用可顯著抑制PDTO的再生能力(圖1f)，這證實了mTOR信號是存活類器官中5-FU抗性的關鍵。通過raptor(也稱為RPTR)下調(diào)也可以觀察到PDTOs對5-FU敏感性的增強(圖1g,h)。這些結果在體內(nèi)得到證實，與未治療的腫瘤或單獨治療相比，雷帕霉素和5-FU聯(lián)合給藥可導致皮下移植的PDTO顯著消退(圖1i-k)。

2）死亡的腫瘤細胞以旁分泌的方式誘導mTOR存活信號

為了研究細胞死亡誘導的mTOR激活是否以旁分泌方式發(fā)生，我們利用了Lgr5eGFP-DTR+小鼠。該小鼠可以在白喉毒素（DT）處理下特異性殺死上皮腫瘤細胞，因此可以對存活的未表達轉基因的周圍細胞類群進行研究。我們從AOM–DSS誘導的Lgr5eGFP-DTR+小鼠腫瘤中建立了類器官，并證實單次DT給藥后p70 S6激酶、PRAS40和S6核糖體蛋白的磷酸化增強(圖2a)。腫瘤類器官中單獨的Lgr5+細胞消融不會導致腫瘤類器官的大體形態(tài)或生長速率發(fā)生顯著變化(圖2b)。然而，雷帕霉素聯(lián)合DT對mTOR的抑制導致細胞在24小時內(nèi)大量死亡(圖2b)，并且在補種時形成類器官的能力大大降低，這在單獨使用任何一種化合物時都沒有觀察到(圖2c)。與mTORC1在Lgr5+細胞損失下存活的關鍵作用一致，在AOM-DSS處理的Villin-creERT2、raptorF/F、Lgr5eGFP-DTR+小鼠的腫瘤組織塊中，他莫西芬誘導的raptor缺失證實了DT處理后腫瘤組織體的再生長能力大大降低(圖2d,e)。為了產(chǎn)生更具有侵襲性的腫瘤類器官，可以在皮下生長，我們通過逆轉錄病毒或慢病毒轉導，將一種組成性活性形式的AKT (myristoylated AKT)，突變KRAS(KRAS(G12D))和一種活性形式的Notch1 (Notch胞內(nèi)結構域)引入到AOM–DSS誘導的Lgr5eGFP-DTR+小鼠的腫瘤類器官中。此外，通過CRISPR-cas9介導的基因編輯敲除Tgfbr2，導致AOM-DSS (ATKN)腫瘤類器官(圖2f)。在AOM-DSS (ATKN)腫瘤類器官中，DT誘導的Lgr5+細胞消融也觸發(fā)了S6核糖體蛋白磷酸化(圖2g)。值得注意的是，在DT+雷帕霉素聯(lián)合治療下，皮下生長的AOM–DSS(ATKN)腫瘤類器官中Lgr5?細胞也被誘導凋亡，這一效應通過cleaved caspase 3染色的免疫組織化學分析得到證實(圖2h)。凋亡在12小時達到峰值，明顯超過單純接受DT或雷帕霉素的小鼠觀察到的水平(圖2h)。因此，DT和雷帕霉素聯(lián)合治療24小時后，可存活的Ki-67+腫瘤細胞大量減少(圖2i)，治療8天內(nèi)腫瘤幾乎完全消退(圖2j-l)。相比之下，單藥雷帕霉素或DT給藥治療在抑制腫瘤生長方面效率較低，并導致腫瘤停滯。總的來說，這些數(shù)據(jù)證實了腫瘤細胞死亡在鄰近的上皮細胞中誘導了一種新的mTOR依賴。

3）垂死的腫瘤細胞釋放ATP，通過P2X4觸發(fā)mTORC1

細胞死亡導致?lián)p傷相關分子模式的釋放，包括各種生長因子、炎癥介質(zhì)、線粒體DNA (mtDNA)、活性氧(ROS)和代謝產(chǎn)物，引發(fā)炎癥并激活先天免疫以阻止損傷并協(xié)調(diào)組織修復和傷口愈合。為了探索引起旁分泌mTORC1激活的機制，我們用載液或DT處理的Lgr5eGFP-DTR(+)腫瘤類器官的上清液處理Lgr5eGFP-DTR(?)腫瘤類器官2小時，并證實暴露于DT處理細胞的上清液的類器官中S6核糖體蛋白磷酸化增加(圖3a)。我們關注的是細胞外ATP，它們可以被存在于腫瘤微環(huán)境中的ATP水解酶水解，產(chǎn)生ADP和腺苷。我們證實，DT處理開始后6-10小時，ATP (0.1-1 μ M)顯著釋放到含Lgr5+類器官的上清液中(圖3b)。在相當濃度范圍內(nèi)添加細胞外ATP可誘導Lgr5eGFP-DTR(?)腫瘤類器官中S6核糖體蛋白磷酸化(圖3c)。同樣，壞死性結直腸癌細胞的上清液也含有大量的ATP(圖3d)，在小鼠和人類來源的腫瘤類器官和癌細胞中觸發(fā)S6磷酸化(圖3e)。使用apyrase水解凋亡或壞死細胞上清液中的ATP可阻止S6磷酸化(圖3f,g)。此外，使用非選擇性P2受體拮抗劑(50 μ M茶堿、20 ng ml?1百日咳毒素和30 μM PPADS)聯(lián)合5-FU阻斷嘌呤能受體，并復制了雙重5-FU -雷帕霉素治療對類器官存活的影響(圖3h)?？偟膩碚f，這些結果支持細胞外ATP釋放導致旁分泌mTORC1激活的觀點。

ATP信號通過P2家族的嘌呤能受體，該家族包括7個P2X受體亞型和8個(小鼠7)P2Y受體亞型。為了檢查一種或幾種不同的受體亞型是否可能參與觀察到的信號級聯(lián)，我們測定了人類未轉化和腫瘤類器官以及小鼠腫瘤類器官中所有已知亞型的基因表達，并檢測到P2X4的顯著表達(圖3i)。使用選擇性抑制P2X4可以減少ATP誘導的PDTOs中S6磷酸化，而選擇性P2X1 (NF279)和P2X7 (A-438079)抑制劑則沒有效果(圖3j)。因此，與單獨治療相比，5-BDBD與5-FU聯(lián)合使用會降低PDTO的生存期(圖3k)。在離體培養(yǎng)的類器官(圖3l-n)和皮下腫瘤(圖3o-q)中，P2X4在PDTOs中的敲除可消融壞死培養(yǎng)基誘導的S6磷酸化，并顯著增強5-fu介導的細胞毒性。

4）mTOR抵消ROS依賴的細胞凋亡誘導

我們的數(shù)據(jù)清楚地表明，細胞死亡在存活的腫瘤細胞中誘導了旁分泌ATP依賴的P2X4介導的mTORC1激活。值得注意的是，存活的腫瘤細胞在誘導鄰近細胞凋亡之前不依賴于mTOR，因為單獨抑制mTOR不會導致可比的腫瘤消退。因此，我們推斷死亡細胞在鄰近的腫瘤上皮細胞中誘導第二個促凋亡的信號級聯(lián)，該信號級聯(lián)被mTORC1通過P2X4同時激活所抵消。與這一觀點一致，使用zVAD抑制細胞凋亡逆轉了5-FU和雷帕霉素聯(lián)合使用對類器官存活的協(xié)同作用，而不會對單獨使用5-FU產(chǎn)生深刻影響(圖4a)。為了檢查5- fu依賴性釋放的其他特征良好的損傷相關分子模式是否可能參與鄰近腫瘤細胞中促凋亡信號的誘導，我們阻斷了氧自由基(n -乙酰半胱氨酸(NAC))、mtDNA (STING抑制劑C-176和C-178)、HMGB1(中和抗體)、TNF (Enbrel)或IL-1α (sIL-1ra;anakinra)。值得注意的是，只有NAC清除ROS能夠防止5- fu -雷帕霉素處理的類器官的存活率下降(圖4b)，這也可以在維生素E類似物拮抗ROS形成時得到證實(圖4c)。當將這些抗氧化劑添加到5-fu處理過的P2X4沉默的PDTO中時，可以觀察到同樣的保護作用(圖4d)。此外，2 ',7 ' -二氯熒光素二乙酸染色顯示給藥5-FU后ROS生成增加(圖4e)。NAC處理還阻止了雷帕霉素處理的Lgr5+細胞消融類器官的caspase 3切割(圖4f)，證實ROS誘導的細胞死亡確實以旁分泌方式觸發(fā)。這與H2AX磷酸化的變化相關，表明旁分泌ROS水平升高可誘導DNA損傷，這可能與細胞死亡誘導有關(圖4f)。重要的是，NAC可減少DT-雷帕霉素處理小鼠24小時后腫瘤組織的凋亡(圖4g)，并完全阻止5-fu-雷帕霉素處理小鼠的腫瘤生長抑制(圖4h-k)。

結論：

這項研究發(fā)現(xiàn)了一種腫瘤中響應周圍細胞死亡的復雜信號通路，腫瘤細胞死亡釋放ATP激活P2X4，導致mTOR依賴，促進周圍細胞存活，同時還會釋放ROS促進周圍細胞死亡。這種促凋亡和抗凋亡的平衡為傳統(tǒng)的腫瘤細胞促凋亡治療提供了一個新的思路。

參考文獻：

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