轉移仍然是小細胞肺癌(SCLC)相關死亡的主要原因。越來越多的證據表明，腫瘤轉移與以抗炎反應、免疫抑制和腫瘤來源的外泌體存在為特征的轉移前微環境有關。為了闡明這些因素在SCLC中的關系，我們分析了SCLC患者樣本和小鼠模型。我們發現，M2 TAM標記CD206+的高表達與SCLC患者較差的預后和轉移狀態相關。此外，在SCLC小鼠模型的轉移灶中發現浸潤性巨噬細胞(M?)。我們觀察到M2極化，并伴有NLRP6表達的增加。我們的研究結果首次表明SCLC來源的外泌體通過NLRP6/NF-κB通路誘導M2開關，從而促進SCLC在體外和體內的轉移。總的來說，這些結果表明了一種新的機制，SCLC來源的外泌體通過激活NLRP6誘導遠處M?的免疫抑制，進而促進全身轉移。在這里，我們強調了腫瘤來源的外泌體、炎癥小體和免疫微環境在SCLC轉移中的密切關系。本文于2022年10月發表于“Cell Death and Disease”（IF= 9.685）上。

技術路線

結果

1）M2 TAMs與SCLC患者轉移和不良預后相關

我們在患者的腫瘤組織切片中分析TAM標記物CD68和M2標記物CD206的表達。我們發現CD68+和CD206+ M?主要位于腫瘤間質。CD68表達水平無明顯差異。然而，CD206在遠處轉移患者中的表達明顯高于沒有遠處轉移的患者(圖A)。在此之后，我們統計了CD206+ TAM的數量。根據中位數，將患者分為CD206+ TAM低表達和高表達兩組。腫瘤間質中，高水平的CD206與轉移和NLRP6高表達相關(圖1B，C)。CD206的高表達也與OS降低相關(圖1D)。數據的單因素和多因素Cox比例風險分析表明CD206是預后不良的獨立危險因素(圖2)。綜上所述，這些結果表明M2 TAMs是SCLC轉移和預后的危險因素。

2）在SCLC裸鼠模型中，NLRP6在轉移灶中表達升高

炎癥微環境是惡性腫瘤免疫調節的關鍵因素。我們分析了GSE116977。基因集富集分析(GSEA)顯示，與轉移部位相比，原發部位的炎癥反應通路顯著富集(圖3A)，表明轉移部位的免疫抑制。此外，包括NLRP6在內的幾種炎癥小體在原發腫瘤和肝轉移腫瘤中表達水平不同。M2 M?標記CD163和IL10在轉移部位上調，而M1標記、NOS2和IL6下調(圖3B)。我們還分析了從RT SCLC尾靜脈注射的同種異體移植模型中分離出來的肺腫瘤(圖3C)。結果表明，與未注射SCLC細胞的小鼠相比，注射SCLC細胞的小鼠M?和M2 M?的比例都更高(圖3D)。為了估計炎癥小體蛋白水平的變化，我們對AIM2、NLRP1、NLRP3、NLRP6和NLRP9進行了qRT-PCR和western blotting分析。令人驚訝的是，與癌旁組織相比，NLRP6在癌組織中的表達顯著上調(圖3E，F)。這些結果表明NLRP6可能與SCLC的M?極化和轉移密切相關。

3）SCLC細胞通過外泌體分泌調節BMDMs的M2極化

為了確定M?極化是否由SCLC細胞誘導，我們聯合培養了BMDMs和小鼠RT SCLC細胞。與SCLC細胞共孵育48小時后，收集BMDMs進行分析。流式細胞儀和qRT-PCR分析顯示M2標記物Arg-1和CD206的表達顯著升高。相比之下，M1標記物CD86和NOS2的表達沒有明顯變化。此外，他們表達了較高水平的M2標記物IL10(圖4A-C)。然后我們研究了SCLC細胞在不直接接觸的情況下影響BMDM的機制。我們發現在DMA治療后的BMDMs中，M?表型轉換為M2(圖4D，E)。為了確定腫瘤來源的外泌體與觀察到的表型轉換有關，將從SCLC細胞培養基中分離出的外泌體(圖4F)添加到BMDMs中，共培養48 h。對上述標志物進行流式細胞術、qRT-PCR和ELISA實驗的結果顯示，來自SCLC的外泌體足以將BMDMs轉換為M2表型(圖4G-I)。因此，這些數據表明SCLC來源的外泌體將M?群體極化為Arg1⁺CD206⁺ M2。

4）SCLC來源的外泌體對TAM極化的調控依賴于NLRP6/NF-κB通路

NLRP6先前已被證明可以抑制細胞的炎癥反應。考慮到上述發現，我們假設SCLC來源的外泌體通過NLRP6途徑促進TAM極化。通過qRT-PCR和western blotting檢測NLRP6在BMDMs共培養后的表達變化。在與RT SCLC細胞或外泌體直接共培養后，NLRP6在BMDMs中的表達顯著升高。同時，DMA培養可逆轉這種表型(圖5A, B)。由于NLRP6負向調控NF-κB信號通路，我們檢測了共培養BMDMs中p65和IκB的水平。在總p65和IκB水平保持不變的情況下，磷酸化p65和磷酸化IκB水平顯著下降，表明NLRP6可能負向調控了NF-κB的激活。外泌體提取前的DMA處理逆轉了對磷酸化IκB和磷酸化p65的作用(圖5C)。因此，在SCLC腫瘤來源的外泌體誘導的M?極化中，NF-κB是NLRP6的關鍵下游因子。為了進一步研究腫瘤來源的外泌體、NLRP6表達和M?表型開關之間的相關性，我們通過siRNA沉默降低了BMDMs中的NLRP6表達。通過western blotting和qRT-PCR分析轉染效率(圖5D)。與上述結果一致，敲低NLRP6可以促進IκB和p65的磷酸化(圖5E)。此外，在SCLC來源的外泌體處理后，敲除組的BMDMs未能切換到M2表型(圖5F-H)。敲低組和陰性對照組M1標記物的水平也相當(圖5F-H)。總之，這些結果支持SCLC來源的外泌體通過NLRP6/NF-κB通路促進M?中的M2開關的觀點。

5）SCLC來源的外泌體促進體內轉移

為了進一步驗證SCLC來源的外泌體對M2 M?極化的影響，在裸鼠體內注射外泌體1周后進行流式細胞術分析。與注射PBS的對照組相比，外泌體處理的小鼠肺和脾臟中CD206+ M?的比例明顯更高(圖6A)。為了確定SCLC來源的外泌體是否促進體內轉移，將小鼠RT SCLC細胞分離的外泌體靜脈注射到SCLC尾靜脈注射的異體移植物模型中(圖6B)。4周后，統計肺部腫瘤的數量。外泌體治療組的肺SCLC腫瘤數量明顯高于對照組。免疫組化結果顯示，與對照組相比，外泌體處理組NLRP6和p65磷酸化水平升高(圖6C-F)。

結論：

我們的研究揭示了SCLC來源的外泌體與M?表型切換的關系，其涉及NLRP6/ NF-κB通路的激活，從而促進SCLC的體內轉移。本研究對炎癥因子的研究為預防SCLC轉移提供了新的方向。

參考文獻：

Rao X, Zhou X, Wang G, Jie X, Xing B, Xu Y, Chen Y, Li J, Zhu K, Wu Z, Wu G, Wu C, Zhou R. NLRP6 is required for cancer-derived exosome-modified macrophage M2 polarization and promotes metastasis in small cell lung cancer. Cell Death Dis. 2022 Oct 21;13(10):891. doi: 10.1038/s41419-022-05336-0.