肝細(xì)胞癌（HCC）在全球?qū)е掳┌Y相關(guān)死亡的惡性腫瘤中排名第四。lncRNA是肝癌發(fā)生的關(guān)鍵模式。作為最常見(jiàn)的mRNA修飾形式，m6A通過(guò)影響mRNA代謝的多個(gè)方面來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。然而，目前還沒(méi)有關(guān)于肝癌中m6A甲基化lncRNA的全基因組篩選和功能注釋的報(bào)道。在系統(tǒng)分析了HCC細(xì)胞的m6A-seq數(shù)據(jù)后，我們確定了22個(gè)具有明顯失調(diào)的m6A水平的候選lncRNAs。在這些lncRNAs中，我們發(fā)現(xiàn)ARHGAP5-AS1是m6A修飾水平最高的lncRNA，并且在HCC標(biāo)本中表達(dá)顯著增加。METTL14作為ARHGAP5-AS1的m6A writer，IGF2BP2作為m6A reader穩(wěn)定lncRNA。ARHGAP5-AS1在體內(nèi)外顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞的惡性行為。我們?cè)贖CC中發(fā)現(xiàn)CSDE1作為lncRNA的相互作用蛋白，TRIM28作為CSDE1的E3連接酶。有趣的是，ARHGAP5-AS1可以減弱CSDE1和TRIM28之間的相互作用，這通過(guò)泛素蛋白酶體途徑阻止CSDE1的降解。CSDE1水平的升高協(xié)調(diào)致癌RNA調(diào)節(jié)，促進(jìn)VIM和RAC1的翻譯，激活ERK通路，這有助于HCC的預(yù)后。我們的研究揭示了m6A修飾的lncRNA控制CSDE1介導(dǎo)的致癌RNA調(diào)控的新模式，并強(qiáng)調(diào)lncRNA是未來(lái)治療HCC的潛在靶點(diǎn)。本文于2022年10月發(fā)表于“Clinical and Translational Medicine”（IF=8.554）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）m6A修飾的ARHGAP5-AS1由METTL14和IGF2BP2控制

為了鑒定在HCC進(jìn)展中被m6A修飾的lncRNA，我們系統(tǒng)分析了METTL14沉默或不沉默的HepG2細(xì)胞的m6A-seq數(shù)據(jù)（圖1A）。HepG2細(xì)胞中有22個(gè)lncRNA具有顯著差異的m6A修飾。在這些lncRNA中，8個(gè)lncRNAs（ARHGAP5-AS1、LINC00152、C1QTNF1-AS1、LINC00969、USP27X-AS1、NDUFB2-AS1、TEN1-CDK3和ABALON）的水平與TCGA肝癌（LIHC）患者的預(yù)后顯著相關(guān)。我們驗(yàn)證了這些候選lncRNA在HCC細(xì)胞中的m6A修飾水平（圖1B）。m6A RIP分析表明ARHGAP5-AS1是肝癌細(xì)胞中m6A修飾水平最高的lncRNA。通過(guò)在HepG2中使用m6A-seq和SRAMP算法，我們鑒定了ARHGAP5-AS1 RNA的三個(gè)潛在m6A位點(diǎn)（876A、890A和928A）（圖1C）。隨后的m6A特異性RIP偶聯(lián)RT-qPCR分析表明，與異位表達(dá)WT ARHGAP5-AS1的細(xì)胞相比，異位表達(dá)ARHGAP5-AS1突變體3的細(xì)胞中ARHGAP5-AS1 RNA的m6A水平顯著降低（圖1D，E）。我們接下來(lái)研究了我們HCC患者隊(duì)列中的m6A-ARHGAP5-AS1 RNA水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤的m6A-ARHGAP5-AS2 RNA水平明顯高于正常組織（圖1F）。細(xì)胞中沉默METTL14后（圖1G），我們觀察到m6A修飾水平和ARHGAP5-AS1的表達(dá)水平明顯降低（圖1H，I）。與此一致，METTL14和ARHGAP5-AS1在HCC組織和正常肝組織中的表達(dá)存在顯著相關(guān)性（圖1J）。RIP-qPCR測(cè)定表明，IGF2BP2是與HCC細(xì)胞中ARHGAP5AS1具有最高結(jié)合親和力的閱讀蛋白（圖1K）。IGF2BP2的沉默顯著降低了HCC細(xì)胞中ARHGAP5-AS1的內(nèi)源性水平（圖1L，M）?？傊@些數(shù)據(jù)闡明METTL14作為ARHGAP5-AS1的m6A寫入器，IGF2BP2作為其m6A讀取器，穩(wěn)定HCC細(xì)胞中ARHGAP5-AS1。

2）ARHGAP5-AS1在體外和體內(nèi)促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖

為了探討ARHGAP5-AS1在肝癌發(fā)生中的作用，我們首先在山東隊(duì)列和江蘇隊(duì)列的HCC標(biāo)本和配對(duì)正常組織中檢測(cè)了其水平（圖2A）。與山東隊(duì)列或江蘇隊(duì)列中的正常肝臟樣本相比，HCC組織中ARHGAP5-AS1明顯上調(diào)（圖2A）。HCC標(biāo)本中高ARHGAP5-AS1水平與無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）或總生存期（OS）的縮短相關(guān)（圖2B）。為了揭示ARHGAP5-AS1在HCC中的生物學(xué)意義，我們開發(fā)了穩(wěn)定的ARHGAP5AS1-KD HepG2和SK-HEP-1細(xì)胞和穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-OE HCC細(xì)胞。如圖2C所示，與對(duì)照組相比，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD明顯抑制了HCC細(xì)胞株的增殖。穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1OE可顯著增強(qiáng)HCC細(xì)胞增殖（圖2D）。集落形成結(jié)果也支持ARHGAP5-AS1在HCC中的致癌作用（圖2E）。然后我們?cè)隗w內(nèi)檢測(cè)了ARHGAP5-AS1的致癌功能。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照異種移植相比，ARHGAP5-AS1-KD HCC異種移植生長(zhǎng)明顯緩慢（圖2F）。與對(duì)照組相比，ARHGAP5-AS1-KD組的腫瘤重量也明顯降低（圖2F），這支持ARHGAP5-AS1在HCC中的致癌作用。

3）ARHGAP5-AS1降低HCC細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力

我們?cè)u(píng)估了ARHGAP5-AS1在體外和體內(nèi)HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為中的作用。ARHGAP5-AS1的穩(wěn)定沉默顯著削弱了HepG2或SK-HEP-1細(xì)胞的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性（圖3A）。相反，ARHGAP5-AS1的強(qiáng)制表達(dá)促進(jìn)了HepG2或SK-HEP-1細(xì)胞的遷移（圖3B）。Matrigel侵襲試驗(yàn)表明ARHGAP5-AS1-KD損害了HCC細(xì)胞的侵襲（圖3B）。相反，ARHGAP5-AS1的過(guò)表達(dá)加速了HCC細(xì)胞的侵襲（圖3B）。體內(nèi)HCC轉(zhuǎn)移結(jié)果顯示，注射惡性細(xì)胞后，ARHGAP5AS1的沉默可顯著損害HCC細(xì)胞的肺和其他器官的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（圖3C）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明ARHGAP5-AS1可以增強(qiáng)體內(nèi)外HCC細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性。

4）ARHGAP5-AS1通過(guò)蛋白酶體抑制CSDE1降解

越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA在腫瘤發(fā)生過(guò)程中可能通過(guò)與各種蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮作用。因此，我們假設(shè)ARHGAP5-AS1可能作為結(jié)合某些蛋白質(zhì)的支架來(lái)促進(jìn)HCC的發(fā)展。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們檢查了ARHGAP5-AS1的細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)ARHGAP5-AS1幾乎同樣存在于HCC細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中（圖4A）。使用質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)，我們鑒定了多種癌癥相關(guān)蛋白，包括CSDE1、ZC3HAV1、CCT8、CKAP4、PARP1、PEG10和APEX1在HepG2中的表達(dá)。在HCC細(xì)胞中進(jìn)行了獨(dú)立檢測(cè)，并成功驗(yàn)證了這些候選蛋白中的CSDE1（圖4B）。與此一致，HCC細(xì)胞系中RNA-CSDE1復(fù)合物中存在顯著的ARHGAP5-AS1富集（圖4C）。為了探索lncRNA與CSDE1相互作用所需的特定結(jié)構(gòu)域，我們隨后構(gòu)建了各種截短的CSDE1（圖4D），并發(fā)現(xiàn)CSDE1 RNA結(jié)合基序2（aa450-525）是ARHGAP5-AS1與蛋白質(zhì)相互作用所必需的（圖4E）。有趣的是，ARHGAP5-AS1的沉默顯著抑制了HCC細(xì)胞中的CSDE1蛋白水平（圖4F）。相反，過(guò)表達(dá)的ARHGAP5-AS1顯著上調(diào)了HepG2和SK-HEP-1細(xì)胞中的CSDE1蛋白（圖4F）。與對(duì)照HCC細(xì)胞相比，MG132處理ARHGAP5-AS1-KD HCC細(xì)胞增加了內(nèi)源性CSDE1蛋白的表達(dá)（圖4G）。相反，MG132消除了ARHGAP5-AS1誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞中CSDE1蛋白的上調(diào)（圖4G），說(shuō)明lncRNA可能調(diào)節(jié)CSDE1的蛋白酶體降解。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們接下來(lái)檢測(cè)了用蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理過(guò)的HepG2和SK-HEP-1細(xì)胞中CSDE1的表達(dá)。Western Blot的結(jié)果表明，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD HCC細(xì)胞中CSDE1的蛋白質(zhì)水平下降速度比對(duì)照細(xì)胞中的快得多（圖4H）。相反，用CHX處理過(guò)表達(dá)ARHGAP5-AS1的HCC細(xì)胞導(dǎo)致CSDE1蛋白的半衰期明顯長(zhǎng)于對(duì)照細(xì)胞（圖4I）。然后，我們研究了ARHGAP5-AS1控制的CSDE1降解是否由CSDE1的泛素化介導(dǎo)。與對(duì)照組相比，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD HCC中觀察到CSDE1蛋白的泛素水平明顯增加（圖4J）。與此一致，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)ARHGAP5-AS1的細(xì)胞中CSDE1的泛素化降低（圖4J）?？傊?，這些結(jié)果闡明了ARHGAP5-AS1通過(guò)抑制CSDE1蛋白的蛋白酶體降解來(lái)穩(wěn)定CSDE1蛋白。

5）ARHGAP5-AS1阻斷CSDE1與其E3連接酶TRIM28的相互作用

為了揭示ARHGAP5-AS1如何延緩CSDE1的蛋白酶體降解，我們通過(guò)質(zhì)譜系統(tǒng)地評(píng)估了由CSDE1在HepG2細(xì)胞中沉淀的蛋白質(zhì)。在所有鑒定的蛋白質(zhì)中，只有兩種E3連接酶（TRIM28和HERC5）。為了確認(rèn)TRIM28或HERC5是否是CSDE1的E3連接酶，我們首先檢測(cè)了TRIM28和HERC5沉默的HCC細(xì)胞中的CSDE1水平（圖5A，B）。在敲除TRIM28表達(dá)后，與對(duì)照細(xì)胞相比，在HCC細(xì)胞中檢測(cè)到升高的CSDE1蛋白水平（圖5A）。然而，HERC5沉默后，沒(méi)有觀察到這種表達(dá)變化（圖5B）。內(nèi)源性TRIM28可以在HepG2或SK-HEP-1細(xì)胞中與CSDE1免疫沉淀（圖5C）。內(nèi)源性CSDE1也可以用TRIM28在HepG2或SK-HEP-1細(xì)胞中沉淀（圖5D）。免疫熒光分析顯示，TRIM28和CSDE1在HCC細(xì)胞中表現(xiàn)出明顯的共定位（圖5E）。我們接下來(lái)研究ARHGAP5-AS1是否影響HCC細(xì)胞中CSDE1與TRIM28的結(jié)合。與對(duì)照組相比，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD HepG2或SK-HEP-1細(xì)胞中的CSDE1可以沉淀更多的TRIM28蛋白（圖5F）。相反，與對(duì)照細(xì)胞相比，穩(wěn)定的ARHGAP5AS1-OE HCC細(xì)胞中用CSDE1沉淀的TRIM28蛋白較少（圖5G）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明ARHGAP5-AS1通過(guò)減弱CSDE1與TRIM28的相互作用來(lái)促進(jìn)CSDE1的穩(wěn)定。

6）ARHGAP5-AS1-CSDE1軸促進(jìn)HCC細(xì)胞中VIM和RAC1的蛋白表達(dá)以及ERK的磷酸化

多條證據(jù)表明，RNA結(jié)合蛋白CSDE1在癌癥中充當(dāng)癌基因，并在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和穩(wěn)定性。事實(shí)上，CSDE1的沉默顯著抑制了HCC細(xì)胞的增殖和克隆形成（圖6A–C）。transwell分析表明CSDE1的siRNA可以顯著抑制HCC細(xì)胞的侵襲能力（圖6D）。與這些數(shù)據(jù)一致，在兩個(gè)隊(duì)列中，與正常樣本相比，HCC組織中的CSDE1表達(dá)顯著升高。TCGA LIHC隊(duì)列中CSDE1異常高表達(dá)與患者OS明顯縮短相關(guān)（圖6F），表明CSDE1在HCC中的致癌性質(zhì)。在CSDE1沉默后，我們觀察到HCC細(xì)胞中VIM（Vimentin）和RAC1的蛋白水平明顯降低（圖6G）。同樣，與對(duì)照組相比，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD HepG2或SK-HEP-1細(xì)胞中的VIM和RAC1表達(dá)下調(diào)（圖6H）；而異位ARHGAP5-AS1表達(dá)顯著提高了VIM和RAC1的表達(dá)(圖6I)。有趣的是，ARHGAP5-AS1或CSDE1的敲除降低了細(xì)胞中ERK1/2（Thr202/Tyr204）的磷酸化（圖6G，H）。異位ARHGAP5-AS1明顯增強(qiáng)了細(xì)胞中ERK1/2磷酸化（圖6I）。總之，這些數(shù)據(jù)證明了ARHGAP5-AS1在穩(wěn)定CSDE1蛋白、促進(jìn)VIM和RAC1翻譯以及激ERK信號(hào)傳導(dǎo)方面的作用（圖6J）。

結(jié)論：

我們發(fā)現(xiàn)由于ARHGAP5-AS1的高m6A甲基化水平，lncRNA表達(dá)顯著升高，加速VIM和RAC1的翻譯，并刺激ERK信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。我們研究揭示了m6A修飾的lncRNA控制CSDE1介導(dǎo)的致癌RNA調(diào)控的新模式，并強(qiáng)調(diào)lncRNA是未來(lái)治療HCC的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Liu J, Zhang N, Zeng J, Wang T, Shen Y, Ma C, Yang M. N6 -methyladenosine-modified lncRNA ARHGAP5-AS1 stabilises CSDE1 and coordinates oncogenic RNA regulons in hepatocellular carcinoma. Clin Transl Med. 2022 Nov;12(11):e1107. doi: 10.1002/ctm2.1107.