腦轉(zhuǎn)移(BM)是惡性黑色素瘤(MM)的常見并發(fā)癥，生存期較差。預(yù)防BM可能比治療已確診的BM更有效和具有更好的耐受性。為了研究BM形成過程中PI3K/Akt/mTOR (PAM)通路激活的時空動態(tài)及其抑制的預(yù)防潛力，我們使用Akt生物傳感器進(jìn)行體內(nèi)分子成像，并通過小鼠慢性顱腦窗進(jìn)行長期活體多光子顯微鏡觀察。體內(nèi)分子成像顯示，在大腦定植的最初步驟中，PAM通路的激活是不變的。為了實(shí)現(xiàn)長期的血管內(nèi)阻滯和外滲，循環(huán)MM細(xì)胞需要在這一過程中激活其PAM通路。然而，在已確診的人類腦轉(zhuǎn)移瘤中，PAM通路被相當(dāng)不均一地激活，而其與腦滲透PAM抑制劑GNE-317的抑制作用僅在小鼠中產(chǎn)生中等的治療效果。相比之下，在預(yù)防計劃中給予包括極低劑量在內(nèi)的GNE-317，有效地降低了兩個MM小鼠模型中BM的生長速度和數(shù)量，并導(dǎo)致總體生存效益。縱向活體多光子顯微鏡發(fā)現(xiàn)BM形成的第一個限速步驟—血管內(nèi)永久阻滯、外滲和血管周圍初始生長—最容易受到PI3K/mTOR的雙重抑制。這些發(fā)現(xiàn)確立了PAM通路激活在早期轉(zhuǎn)移性腦定植的關(guān)鍵步驟中的關(guān)鍵作用，并揭示了其藥理抑制是預(yù)防臨床相關(guān)BM形成的有效途徑。本文于2022年2月發(fā)表于Neuro-Oncology (IF=13.029)上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

(1) Akt生物傳感器測量PAM通路調(diào)控的動態(tài)

為了全面了解PAM通路在腦轉(zhuǎn)移形成過程中的作用，我們在體內(nèi)實(shí)時監(jiān)測腫瘤細(xì)胞中腦轉(zhuǎn)移級聯(lián)每個后續(xù)步驟的PAM通路激活情況。腦轉(zhuǎn)移性A2058黑色素瘤細(xì)胞被用綠色熒光Akt生物傳感器轉(zhuǎn)導(dǎo)，在Akt刺激的情況下，該傳感器迅速從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。首先，對Akt生物傳感器進(jìn)行體外驗(yàn)證。增殖細(xì)胞有傳感器的細(xì)胞質(zhì)信號，表明Akt活性高，而接受穿透腦的雙重PI3K/mTOR抑制劑(GNE-317)或選擇性泛I類PI3K抑制劑(pictilisib)攻擊的細(xì)胞有表明Akt活性低的核信號(圖1A)。為了量化Akt活性，計算了GFP信號的細(xì)胞質(zhì)/核比，結(jié)果證實(shí)了兩者之間的魯棒性差異(圖1B)。當(dāng)GNE-317或pictilisib處理腫瘤細(xì)胞時，磷酸化(p)-S6RP、p-Akt和p-mTOR水平較低(圖1C)。在GNE-317和pictilisib處理的細(xì)胞中，流式細(xì)胞術(shù)檢測到較少的p-Akt (Ser473)(圖1D)。

圖1：Akt生物傳感器的建立和驗(yàn)證，以測量PAM通路的激活。

(2) 循環(huán)腫瘤細(xì)胞在早期腦定植過程中迅速激活PAM通路

接下來，我們對腦定植癌細(xì)胞中PAM通路在腦轉(zhuǎn)移級聯(lián)的每個后續(xù)步驟中的動態(tài)調(diào)節(jié)進(jìn)行研究。我們將表達(dá)RFP和Akt傳感器的A2058黑色素瘤細(xì)胞向小鼠心內(nèi)注射，通過慢性顱窗通過重復(fù)活體多光子顯微鏡進(jìn)行分子成像(圖2A)。在注射Akt活性較低的細(xì)胞群后的兩小時內(nèi)，在大腦微血管中捕獲的腫瘤細(xì)胞中，約77%顯示出細(xì)胞質(zhì)GFP信號，表明PAM通路被激活(圖2B)。成功外滲后，所有癌細(xì)胞均表現(xiàn)出較高的Akt活性(圖2B)。隨著時間的推移，對所有腫瘤細(xì)胞進(jìn)行跟蹤發(fā)現(xiàn)，只有那些在血管內(nèi)階段具有高Akt活性的細(xì)胞才能成功地外滲并定居血管周圍小龕(圖2C,D)。Akt活性低的血管內(nèi)細(xì)胞(23%，n=16)不太可能獲得永久阻滯，且從未觀察到外滲事件(圖2D)。綜上所述，縱向監(jiān)測體內(nèi)PAM通路的激活表明，早在腦部腫瘤細(xì)胞停滯的血管內(nèi)階段就開始的穩(wěn)健和持久的PAM通路激活，對外滲和隨后的黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移形成至關(guān)重要。

圖2：PAM通路激活是黑素瘤BM中一個不變的早期事件。

(3) 腦轉(zhuǎn)移瘤中PAM通路的異質(zhì)性激活

通過分析轉(zhuǎn)移性MM(圖3A)和其他癌癥患者的組織芯片數(shù)據(jù)，確認(rèn)了PAM通路在人類BM中的激活。這些已確診的人體BM在許多情況下顯示了PAM通路的激活，但激活模式相當(dāng)不均一(圖3B)。結(jié)合生物傳感器研究和一項(xiàng)臨床試驗(yàn)顯示，已確診BM的MM患者對PI3K抑制劑反應(yīng)不足，這為在不同時間表中實(shí)驗(yàn)測試GNE-317的BM抑制效果提供了明確的理論基礎(chǔ)。我們假設(shè)PAM通路抑制劑對BM形成的早期、決定命運(yùn)的步驟有最強(qiáng)的影響，在這些步驟中PAM通路可能發(fā)揮最相關(guān)和一致的作用。

圖3：已確診的人類BM中Akt和mTOR信號通路。

(4) PI3K/mTOR雙重抑制對體外和體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞的影響

接下來我們進(jìn)行了體外和體內(nèi)研究，以調(diào)查PAM通路抑制與BM形成的相關(guān)性。為了驗(yàn)證腦穿透雙PI3K/mTOR抑制劑GNE-317在體內(nèi)的靶向活性，進(jìn)行了活體顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在活體小鼠大腦中轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中存在特定的PAM通路抑制(圖4A)。由于癌細(xì)胞的增殖能力決定了大規(guī)模轉(zhuǎn)移的形成，進(jìn)行了實(shí)時細(xì)胞分析增殖試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在GNE-317處理的H1和A2058黑色素瘤細(xì)胞中(圖4B)，以及在來自人類BM的原代黑色素瘤細(xì)胞系中(補(bǔ)充圖未展示)，增殖呈劑量依賴性減少。通過使用GNE-317進(jìn)行體外處理，凋亡細(xì)胞的比例增加(補(bǔ)充圖未展示)。接下來，我們研究使用腦滲透雙PI3K/mTOR抑制劑GNE-317抑制PAM是否對臨床前環(huán)境中BM形成的早期步驟有效(圖4C)。通過反復(fù)活體多光子顯微鏡觀察A2058黑色素瘤細(xì)胞(表達(dá)細(xì)胞質(zhì)RFP和核GFP)，在轉(zhuǎn)移級聯(lián)的每一步都可以檢測到細(xì)胞的增殖和存活(圖4D)。當(dāng)小鼠在早期(從第4天開始)接受GNE-317治療時，與模擬治療的對照組相比，生長速率顯著降低，個別微轉(zhuǎn)移病灶的存活率也顯著降低(圖4E,F)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，高、最大耐受劑量的GNE-317 (25 mg/kg/d)能夠?qū)φ麄€腦轉(zhuǎn)移級聯(lián)產(chǎn)生有意義的影響，并從大腦定植的最初步驟起就靶向黑素瘤細(xì)胞。

圖4：PI3K/mTOR雙抑制劑對體外和體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞的影響。

(5) PAM通路抑制劑對腦轉(zhuǎn)移的顯著預(yù)防作用

我們研究了早期應(yīng)用一種培養(yǎng)基甚至極低劑量的GNE-317是否能在兩種黑色素瘤BM模型中實(shí)現(xiàn)體內(nèi)預(yù)防BM。使用長期重復(fù)的室內(nèi)多光子顯微鏡，監(jiān)測了四組小鼠的BM發(fā)展情況：在中(12.5 mg/kg/d)或低(2.5 mg/kg/d)劑量預(yù)防性方案中接受GNE-317的小鼠與在BM已經(jīng)形成時開始接受中劑量(12.5 mg/kg/d)治療方案的小鼠(圖5A)。然后用小鼠模型來檢驗(yàn)這個假設(shè)。高血糖是PAM抑制劑常見的臨床副作用。與對照組相比，中劑量的GNE-317導(dǎo)致我們小鼠模型的血糖顯著升高(圖5B)。相比之下，低劑量的GNE-317對血糖水平?jīng)]有顯示出任何顯著的影響，這表明降低劑量確實(shí)可以減少PAM通路抑制劑的關(guān)鍵副作用。

在心內(nèi)注射后第28天，活體多光子顯微鏡顯示，H1和A2058模型的腦膜尺寸在預(yù)防計劃中減小(圖5C)。兩組預(yù)防方案似乎都有效地阻止了小微轉(zhuǎn)移期的轉(zhuǎn)移(圖5D)。對腫瘤形成4周內(nèi)腫瘤生長速率的量化顯示，與對照組相比，兩種預(yù)防計劃確實(shí)有效地阻止了腫瘤細(xì)胞增殖，在第一周效果最強(qiáng)，甚至可觀察到腫瘤體積的暫時減少(圖5E)。低劑量和中劑量預(yù)防方案組的BM生長抑制效果相當(dāng)(圖5E)。第二個H1黑色素瘤模型證實(shí)了預(yù)防低劑量的強(qiáng)烈影響(補(bǔ)充圖未展示)。與預(yù)防方案的結(jié)果相反，12.5 mg/kg/d的GNE-317治療已建立的轉(zhuǎn)移瘤僅對已建立的腦轉(zhuǎn)移瘤的生長產(chǎn)生中等影響(圖5C-E)，這與使用PI3K抑制劑buparlisib治療MM患者時對已建立的腦轉(zhuǎn)移瘤無反應(yīng)一致。這些數(shù)據(jù)表明，在大腦定植的早期階段開始使用GNE-317低劑量給藥具有顯著的好處。

圖5：預(yù)防vs治療計劃。

(6) 縱向活體成像揭示確切的藥物作用

接下來，揭示雙PI3K/mTOR抑制影響的腦轉(zhuǎn)移級聯(lián)的確切步驟。當(dāng)比較注射后3天血管停止到實(shí)驗(yàn)結(jié)束期間轉(zhuǎn)移病灶的總體生存期時，低劑量預(yù)防計劃導(dǎo)致轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量隨著時間的推移而減少(圖6A)。對照組和治療組(治療從第21天開始)之間沒有觀察到顯著差異(圖6A)。在第3天和第7天之間觀察到預(yù)防性計劃對轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量的最強(qiáng)減少(圖6A)。與對照組相比，在低劑量預(yù)防組中，黑色素瘤細(xì)胞外溢到第7天的數(shù)量較少(圖6B,C)。追蹤每個轉(zhuǎn)移病灶的去向發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，預(yù)防治療組小鼠血管周圍小龕中A2058黑色素瘤細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(32.1% vs 77.1%)，同時形成較少的BM (20.2% vs 63.7%)(圖6D)。這在第二個黑色素瘤模型中得到了證實(shí)(圖6D)。在低劑量預(yù)防組與治療組之間也發(fā)現(xiàn)了類似的差異(補(bǔ)充圖未展示)。由于治療組的雙PI3K/mTOR抑制只在外滲后才開始，因此該組可視為本實(shí)驗(yàn)的第二個獨(dú)立對照組。因此，預(yù)防性治療的效果是雙重的：血管外滲和血管周圍生態(tài)位的早期定位點(diǎn)都受到PAM通路抑制的影響(圖6B-D)。在中劑量預(yù)防計劃組和低劑量預(yù)防計劃組之間，已確定轉(zhuǎn)移的形成再次沒有顯著差異(補(bǔ)充圖未展示)。

最后，通過縱向全身生物發(fā)光成像和一項(xiàng)生存研究來證實(shí)PAM通路抑制的抗轉(zhuǎn)移作用。預(yù)防方案中低劑量的GNE-317顯著減少了腦內(nèi)外的轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)，然而，觀察到對顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的作用最強(qiáng)(圖6E)。低劑量預(yù)防計劃顯示了特別強(qiáng)的生存效益(圖6F)。停止給藥GNE-317后，轉(zhuǎn)移瘤生長加速(補(bǔ)充圖未展示)，這說明持續(xù)低劑量給藥可最大程度抑制腦轉(zhuǎn)移瘤。

圖6：腦轉(zhuǎn)移級聯(lián)的早期步驟最容易受到PAM通路的抑制。

結(jié)論：

總之，低劑量腦穿透性PI3K/mTOR雙重抑制劑對預(yù)防腦轉(zhuǎn)移尤其有效，使這種方法成為未來高危MM患者腦轉(zhuǎn)移預(yù)防試驗(yàn)的可行之路。通過一種耐受性良好的藥物，可長期服用，有效地預(yù)防腦轉(zhuǎn)移，可能會在未來對癌癥患者產(chǎn)生真正的影響。

參考文獻(xiàn)：

Tehranian, C., Fankhauser, L., Harter, P. N., Ratcliffe, C., Zeiner, P. S., Messmer, J. M., Hoffmann, D. C., Frey, K., Westphal, D., Ronellenfitsch, M. W., Sahai, E., Wick, W., Karreman, M. A., & Winkler, F. (2022). The PI3K/Akt/mTOR pathway as a preventive target in melanoma brain metastasis. Neuro-oncology, 24(2), 213–225. https://doi.org/10.1093/neuonc/noab159.