放療抵抗是鼻咽癌（NPC）治療失敗的主要原因。以往的研究集中在細胞凋亡缺陷作為一種放療抵抗機制；然而，調節NPC放療敏感性的其他潛在死亡模式尚未被探索。活細胞顯像顯示，40-75%的放療誘導的鼻咽癌死亡細胞為細胞焦亡。此外，放療誘導的焦亡是由GSDME觸發的，GSDME被線粒體內通路中激活的caspase-3所裂解。此外，GSDME在放療抵抗的鼻咽癌標本中明顯下調。GSDME低表達是預后較差的預測因子，并授予鼻咽癌在體外和體內的放療抵抗。機制上，OTUD4去泛素化并穩定GSDME，通過促進焦亡增強鼻咽癌細胞的放療敏感性。臨床上，鼻咽癌活檢中OTUD4與GSDME顯著相關，且OTUD4和GSDME均低表達的患者放療效果最差，生存期最差。總之，GSDME依賴性焦亡是鼻咽癌放療敏感性的關鍵決定因素，由OTUD4通過去泛素化和穩定GSDME調節。這些發現為研究鼻咽癌的放療抵抗提供了一個有前途的新方向，并為鼻咽癌放療敏感提供了潛在的治療靶點。本文于2022年11月發表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=12.658）上。

技術路線

結果

1）放療通過自身線粒體凋亡途徑誘導鼻咽癌細胞GSDME依賴性焦亡

我們觀察到放療導致鼻咽癌細胞焦亡的形態學特征(圖1A)。細胞死亡的性質通過乳酸脫氫酶釋放的增加被進一步確定(圖1B)。圖1C顯示了細胞焦亡、凋亡和存活的典型過程。在6個鼻咽癌細胞系中，放療后的焦亡性細胞比例從4到24%不等(圖1D)。為了確定哪一個gasdermin家族成員負責介導鼻咽癌細胞中放療誘導的焦亡，我們在HONE1細胞中敲除GSDME和GSDMD的表達。抑制GSDME(圖1E)減弱典型的焦亡形態學變化，以及LDH的釋放和細胞活力的降低。同樣，放療后鼻咽癌細胞中觀察到GSDME的裂解，伴隨caspase-3和PARP的裂解以及從線粒體釋放細胞色素c(圖1F)。此外，放療后，焦亡細胞的比例、LDH的釋放、GSDME、PARP和caspase-3的裂解均呈時間和劑量依賴性增加(圖1G-J)。以上數據提示，放療通過固有的線粒體凋亡途徑導致GSDME依賴性焦亡。

2）上調GSDME可增強鼻咽癌細胞的焦亡和放療敏感性

活細胞成像分析顯示，在放療誘導的死亡細胞中，焦亡細胞占很大比例(40%)(圖2A，左)，焦亡細胞/死亡細胞比例與存活比例成反比(圖2A，右)。此外，GSDME-N的相對蛋白水平與6 Gy放療誘導的鼻咽癌細胞株的存活率呈負相關(圖2B)。鼻咽癌細胞普遍表現出高于其他癌細胞的GSDME表達(圖2C)。為了進一步評估GSDME對鼻咽癌細胞放療敏感性的影響，我們構建了穩定過表達GSDME的SUNE1和6-10B細胞(圖2D)。同時，我們使用shRNA沉默了HK1和HONE1細胞中內源性GSDME的表達(圖2E)。SUNE1和6-10B細胞中GSDME的上調導致更明顯的焦亡特征(圖2D)，增加了LDH的釋放(圖2D)，增強了GSDME-N片段的生成(圖2F)，導致了較高比例的焦亡細胞(圖2G)，導致放療后死亡細胞比例更高(圖2J)。另一方面，HK1和HONE1細胞中GSDME的下調導致相反的效果(圖2E, H, I, K)。此外，過表達GSDME增強鼻咽癌細胞的放療敏感性(圖2L)，而敲除GSDME則降低了放療敏感性(圖2M)。這些數據表明，GSDME的上調通過提高GSDME-n在體外的寡聚水平，增強鼻咽癌細胞的焦亡和放療敏感性。

3）GSDME依賴性焦亡可使鼻咽癌在體內對放療敏感

為了探討GSDME是否會影響鼻咽癌在體內的放療敏感性，我們建立了小鼠移植瘤模型。每四天測量一次腫瘤直徑(圖3A)。在沒有放療的情況下，與對照組相比，GSDME上調或沉默的腫瘤在生長速度(圖3B)、熒光信號(圖3C和D)、大小(圖3E)和重量(圖3F)方面沒有觀察到顯著差異。然而，與載體組相比，放療處理后過表達GSDME的腫瘤生長明顯較慢(圖3B)，熒光信號較弱(圖3C和D)，體積較小(圖3E)，重量較輕(圖3F)，而HONE1細胞中GSDME敲除則相反。此外，放療后，過表達GSDME組血清LDH濃度明顯高于載體組，而GSDME敲除組血清LDH濃度較低(圖3G)。切片腫瘤的H&E染色顯示，過表達GSDME能顯著增加放療后腫瘤的炎性壞死面積，沉默GSDME則能減少炎性壞死面積(圖3H)。放療后過表達GSDME的小鼠中GSDME的裂解增加，而沉默GSDME則減少了GSDME的裂解(圖3I)。這些結果表明，GSDME通過介導鼻咽癌細胞在體內的焦亡，增強了鼻咽癌細胞的放療敏感性。

4）GSDME低表達與鼻咽癌放療抵抗和預后不良相關

為了研究GSDME是否參與放療反應，我們在10個新鮮冷凍組織和150個石蠟包埋組織中分析鼻咽癌中GSDME的水平(圖4A)。與放療敏感的鼻咽癌組織相比，放療抵抗的鼻咽癌組織始終表現出較低的GSDME蛋白水平(圖4B)。70.0%(105/150)患者GSDME高表達，30.0%(45/150)患者GSDME低表達(圖4C，D)。放療抵抗的組織中GSDME的IHC評分明顯低于放療敏感組織(圖4E)。隨后的分析顯示，GSDME低表達組比GSDME高表達組放療敏感性鼻咽癌病例比例低(圖4F)。在所有鼻咽癌病例中，較低的GSDME表達與較差的PFS和LRRFS顯著相關(圖4G)。此外，通過多因素Cox回歸分析，GSDME低表達被認為是鼻咽癌5年PFS和5年LRRFS較差的獨立預后因素(圖4H)。此外，在經鼻咽鏡證實的部分GSDME高表達的鼻咽癌放療敏感的患者中，放療治療后血清LDH水平升高(圖4I，4J)。而GSDME低表達的放療抵抗的患者的血清LDH濃度在放療后無明顯上升趨勢(圖4I，4J)。因此，GSDME表達可作為鼻咽癌患者放療敏感性的前瞻性指標，放療后血清LDH濃度的變化可動態監測鼻咽癌患者放療療效。

5）OTUD4去泛素化和穩定GSDME

為進一步探討GSDME在放療抵抗的鼻咽癌中下調的機制，采用real-time PCR方法分析GSDME在放療敏感和放療抵抗的鼻咽癌標本中的mRNA表達。分析顯示GSDME mRNA表達在鼻咽癌放療敏感組織和放療抵抗的組織之間無明顯差異(補充圖)。這一發現表明GSDME的下調可能發生在放療抵抗的鼻咽癌的轉錄后水平。有趣的是，GSDME相互作用蛋白的MS分析集中在去泛素酶OTUD4上(圖5A和B)。在放療抵抗的鼻咽癌細胞中，OTUD4蛋白表達明顯下調(圖5C)。OTUD4和GSDME之間的相互作用通過免疫共沉淀(co-IP)試驗得到證實(圖5D)。為了確定調節OTUD4和GSDME之間相互作用的區域，我們做了OTUD4截斷和GSDME截斷(圖5E)。IP分析顯示，只有截斷的OTUD4包含與GSDME結合的OTU結構域，這表明OTU結構域對于GSDME是必不可少的(圖5F)。此外，GSDME的N端區域負責與OTUD4的相互作用(圖5G)。OTUD4的上調顯著增加GSDME蛋白水平，而OTUD4的敲除則減少它的表達(圖5H)。上調OTUD4顯著延長了內源性GSDME的半衰期，沉默OTUD4減少了鼻咽癌細胞中GSDME的降解半衰期(圖5I和J)。與這些結果一致的是，過表達OTUD4減弱了GSDME的泛素化(圖5K)。這些結果表明，OTUD4促進了NPC中GSDME的去泛素化和穩定性。

6）OTUD4通過促進GSDME依賴性焦亡增強鼻咽癌細胞的放療敏感性

為了進一步研究OTUD4對鼻咽癌細胞焦亡和放療敏感性的影響，我們用GSDME-shRNA轉染過表達或未過表達OTUD4的HONE1和5-8F細胞，然后檢測它們對電離輻射的反應(圖6A)。HONE1和5-8F細胞中OTUD4過表達導致更明顯的焦亡特征(圖6B)，LDH釋放增加(圖6C)，焦亡比例更高(圖6D)，放療后死亡細胞比例更高(圖6E)。此外，集落形成試驗表明，OTUD4過表達可使HONE1和5-8F細胞對放療敏感(圖6F和G)。然而，通過GSDME敲除，OTUD4過表達的表型發生逆轉。OTUD4過表達使異種移植瘤對放療敏感，沉默GSDME成功地削弱了OTUD4在體內對放療敏感性的影響(圖6H-L)。此外，放療后OTUD4過表達組的血清LDH濃度高于對照組，但沉默GSDME恢復了上述趨勢(圖6M)。在過表達OTUD4的腫瘤移植瘤中GSDME蛋白水平更高(圖6N)。更重要的是，上調OTUD4增加了放療后鼻咽癌細胞中GSDME-N的寡聚水平。然而，通過GSDME敲低，OTUD4過表達的影響被逆轉(補充圖)。這些結果表明，OTUD4通過上調GSDME蛋白水平和GSDME-N的寡聚水平，促進鼻咽癌細胞GSDME依賴性焦亡并增強放療敏感性。

7）鼻咽癌中OTUD4/GSDME軸與放療反應的臨床相關性

接下來我們研究了OTUD4下調是否具有臨床意義，以及OTUD4與GSDME是否具有臨床相關性。我們測量了150例鼻咽癌患者相同組織中OTUD4的蛋白水平。典型的GSDME低表達和高表達如圖7A所示。放療抵抗組的OTUD4 IHC評分低于放療敏感組(圖7B)。隨后的分析顯示，OTUD4低表達組的鼻咽癌放療敏感性病例比例低于OTUD4高表達組(圖7C)。在所有鼻咽癌病例中，低OTUD4表達與較差的PFS顯著相關(圖7D)。與OTUD4高表達的患者(圖7E)相比，OTUD4低表達的患者GSDME水平較低，血清LDH濃度無明顯上升趨勢，腫瘤消退較慢(圖7E)。進一步分析顯示，OTUD4與GSDME表達呈正相關(圖7F)。更顯著的是，同時低表達OTUD4和低表達GSDME的患者放療反應(圖7G)、PFS和LRRFS最差(圖7H)。總之，這些數據進一步證實了OTUD4穩定并上調GSDME，而下調OTUD4抑制GSDME依賴性焦亡，導致鼻咽癌的放療抵抗和不良預后。

結論：

我們發現放療通過線粒體凋亡通路誘導鼻咽癌細胞GSDME依賴性焦亡。此外，OTUD4能去泛素化和穩定GSDME，導致GSDME蛋白水平升高和放療誘導的焦亡，最終增強鼻咽癌的放療敏感性。以OTUD4/GSDME軸為靶點誘導焦亡是一種新的鼻咽癌放療敏感策略。

參考文獻：

Di M, Miao J, Pan Q, Wu Z, Chen B, Wang M, Zhao J, Huang H, Bai J, Wang Q, Tang Y, Li Y, He J, Xiang T, Weng D, Wang L, Xia J, Zhao C. OTUD4-mediated GSDME deubiquitination enhances radiosensitivity in nasopharyngeal carcinoma by inducing pyroptosis. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Nov 21;41(1):328. doi: 10.1186/s13046-022-02533-9.