T細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。SLE患者血清來源的外泌體增加，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。作者確定嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP，也稱為人RNase III)在SLE T細(xì)胞衍生的外泌體中過度表達(dá)。迄今為止，ECP在T細(xì)胞功能和自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用仍然未知。在這項(xiàng)研究中，作者表征了來自SLE患者的T細(xì)胞衍生的外泌體，并將ECP鑒定為致病性外泌體蛋白。該研究于2022年1月發(fā)表在《Arthritis & Rheumatology》，IF：15.483。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. SLE患者T細(xì)胞衍生外泌體中CD9和CD63表面標(biāo)志物的鑒定

在收集T細(xì)胞衍生的外泌體之前，純化和培養(yǎng)SLE患者和健康對照的外周血T細(xì)胞72小時。為鑒定SLE患者中富集的外泌體表面蛋白，對T細(xì)胞上清液中的外泌體進(jìn)行MACSPlex檢測(圖1A)。與健康對照組(n=12)相比，SLE患者(n=12)的T細(xì)胞上清液中T細(xì)胞衍生的外泌體數(shù)量顯著增加。在37種表面蛋白中，16種外泌體表面蛋白在SLE患者中增加(圖1B)。SLE患者中T細(xì)胞衍生的CD9+、CD63+、CD62P+和CD45+外泌體數(shù)量較高(信號大于20%)，并且與健康對照組相比顯著增加(圖1B和C)。CD9和CD63是2個眾所周知的外泌體表面標(biāo)志物；有趣的是，與對照組相比，T細(xì)胞衍生的CD9+和CD63+外泌體在SLE患者中的誘導(dǎo)倍數(shù)最高。

圖1. SLE患者中T細(xì)胞衍生的CD9+和CD63+外泌體數(shù)量增加

2. SLE患者的T細(xì)胞衍生外泌體中存在ECP

為表征來自SLE患者的T細(xì)胞來源的外泌體的特性，通過基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析了從SLE患者和健康對照中分離的T細(xì)胞來源的CD9+和CD63+外泌體。蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，SLE患者的T細(xì)胞衍生的CD9+外泌體和CD63+外泌體中分別過表達(dá)了130和140種蛋白質(zhì)，而健康對照組則沒有(圖2A)。此外，在富含類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的外泌體中也觀察到了許多鑒定的外泌體蛋白。在SLE患者中，只有15個CD9+外泌體蛋白和21個CD63+外泌體蛋白選擇性富集，而RA患者則沒有(圖2A)。值得注意的是，在質(zhì)譜分析中包括的所有5個SLE患者樣本的T細(xì)胞外泌體中都檢測到了一種蛋白評分最高的外泌體蛋白ECP(圖2B)。

圖2. SLE患者T細(xì)胞衍生的CD9+和CD63+外泌體中ECP的誘導(dǎo)

3. Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥

為研究富含SLE的外泌體ECP是否在SLE的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，作者生成并表征了Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠。ECP在來自Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞衍生的外泌體中成功過表達(dá)(圖3A)。T細(xì)胞衍生的外泌體的直徑大多小于200 nm(圖3B)。與同齡的野生型小鼠相比，兩個月大的Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的血清促炎細(xì)胞因子IFN-γ水平自發(fā)升高(圖3C)。2個月大的Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平?jīng)]有顯著升高，而8個月大的Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的血清IL-1β和TNF-α水平升高(圖3C)。此外，通過組織學(xué)染色檢測到10個月大的Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝臟、腎臟和關(guān)節(jié)炎癥(圖3D)。血清肌酐和甘油三酯水平升高也分別提示Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生腎炎和肝炎(圖3E)。為研究含有ECP的外泌體是否浸潤到肝臟和腎臟的發(fā)炎組織中，從小鼠組織樣本中分離出外泌體并進(jìn)行免疫印跡。結(jié)果證實(shí)Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠組織含有ECP陽性外泌體(圖3F)。這些結(jié)果表明，Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)地發(fā)展出多種組織類型的炎癥。

圖3. T細(xì)胞特異性ECP-轉(zhuǎn)基因(Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因)小鼠自發(fā)發(fā)展為嚴(yán)重炎癥

4. 從Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞衍生的外泌體后誘導(dǎo)受體小鼠的炎癥反應(yīng)

為證明含有ECP的外泌體的病理功能，來自純化的Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞的外泌體通過靜脈注射過繼轉(zhuǎn)移到野生型受體小鼠中。共聚焦顯微鏡顯示，來自Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞的外泌體(以下簡稱ECP外泌體)浸潤到野生型受體小鼠的肝臟、腎臟和爪子組織中(圖4A)。在過繼轉(zhuǎn)移ECP外泌體4周后，受體小鼠在肝臟、腎臟和關(guān)節(jié)滑膜中顯示出浸潤性免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)(圖4B)。蘇木精和伊紅染色提示ECP外泌體受體小鼠出現(xiàn)肝炎、腎炎和關(guān)節(jié)炎(圖4B)。來自ECP外泌體受體小鼠的肝臟、腎臟和關(guān)節(jié)組織也顯示出高水平的IFN-γ(圖4C)。此外，ECP外泌體的過繼轉(zhuǎn)移刺激了野生型受體小鼠的血清肌酐和甘油三酯水平(圖4D)，分別表明受體小鼠患腎炎和肝炎。受體小鼠的血清ANA和RF水平，而非抗dsDNA水平也升高(圖4E)，表明ECP外泌體誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。總之，這些結(jié)果表明T細(xì)胞衍生的外泌體ECP有助于炎癥反應(yīng)。

圖4. 從Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞衍生的外泌體后WT小鼠的炎癥反應(yīng)

5. 通過在T細(xì)胞中過表達(dá)ECP誘導(dǎo)生長激素(GH)、TNF超家族(TNFSF8)和肌聯(lián)蛋白

為了解驅(qū)動Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性炎癥的潛在T細(xì)胞反應(yīng)，分離了來自8個月大的Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞并進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序。Seurat的降維/聚類分析根據(jù)基因表達(dá)將來自Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠的T細(xì)胞分為11個不同的簇(圖5A)。簇1、2、5、10和11被鑒定為CD4+T細(xì)胞，而簇3、4、6、7、8和9被鑒定為CD8+T細(xì)胞(圖5A)。T細(xì)胞中ECP過表達(dá)導(dǎo)致初始CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少(第3組)、效應(yīng)CD8+T細(xì)胞數(shù)量增加(第4組)和記憶CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加(第2組) (圖5A)。在Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞中，包括CD28和CD69在內(nèi)的51個基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖5B)。在Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞中，多個炎癥相關(guān)基因(如TNFAIP3、TNFSF8、S100a6和IFN-γ)的表達(dá)也顯著增加(圖5B和C)。這些結(jié)果表明T細(xì)胞中的ECP過表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)。

圖5. 通過在T細(xì)胞中過表達(dá)ECP誘導(dǎo)TNF-α信號傳導(dǎo)和IFN-γ產(chǎn)生

6. 在Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠中，濾泡輔助T(Tfh)細(xì)胞和漿B細(xì)胞數(shù)量以及自身抗體水平增加

Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞對IL-21、CXCR5和誘導(dǎo)型共刺激物的mRNA有顯著誘導(dǎo)(圖5D)，它們是Tfh細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)志物。值得注意的是，程序性死亡1(PD-1)mRNA水平在Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞中沒有顯著增加(圖5D)。

為研究Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠中Tfh細(xì)胞群或漿B細(xì)胞群是否增加，通過流式細(xì)胞術(shù)分析了鼠脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，8周齡Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+IL-21+T細(xì)胞和CD4+CXCR5+T細(xì)胞的百分比均增加(圖6A)；這2個T細(xì)胞亞群在16周齡小鼠中進(jìn)一步增強(qiáng)(圖6A)。此外，在16周齡而非8周齡Lck-ECP的脾臟中，成熟B細(xì)胞(B220+CD21+)的百分比增加，而幼稚B細(xì)胞(B220+CD23+)的百分比降低(圖6B)。8周齡Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓中漿B細(xì)胞百分比(B220lowCD138+)適度增加，并在16周齡Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)一步增加(圖6C）。與野生型小鼠相比，8周大的Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的血清ANA水平略有誘導(dǎo)，而16周大的Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的血清ANA水平進(jìn)一步升高(圖6D)。16周齡而非8周齡的Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠的血清RF水平也有所增加(圖6D)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞導(dǎo)致血漿B細(xì)胞數(shù)量增加，從而促進(jìn)隨后的自身抗體產(chǎn)生。

圖6. 在Lck-ECP-轉(zhuǎn)基因小鼠中，濾泡輔助T(Tfh)細(xì)胞和漿B細(xì)胞數(shù)量以及自身抗體水平增加

結(jié)論：

T細(xì)胞或T細(xì)胞衍生的外泌體中的ECP過表達(dá)通過內(nèi)在和外在事件誘導(dǎo)T細(xì)胞過度活化和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，導(dǎo)致多器官炎癥和自身免疫反應(yīng)。因此，過表達(dá)ECP的T細(xì)胞和含有ECP的外泌體是SLE的潛在生物標(biāo)志物。