研究表明，circRNAs的失調與神經疾病有關。然而，帕金森病（PD）中circRNAs的生物發生、調節、功能和機制仍不清楚。在這項研究中，通過對MPTP誘導的PD小鼠和野生型小鼠進行RNA測序，檢測出了33種差異表達的circRNAs（DECs）。實時定量PCR檢測紋狀體（STR）、黑質致密部（SNpc）和血清外泌體中DECs的RNA水平，發現PD小鼠中circSV2b下調。然后，通過體內功能實驗，探討circSV2b對PD的影響，機制研究發現circSV2b直接海綿化miR-5107-5p并減輕對靶基因Foxk1表達的抑制，然后正調控Akt1轉錄。在體內， circSV2b過表達通過ceRNA-Akt1軸抵抗氧化應激損傷。綜上所述，這些發現表明miR-5107-5p-Foxk1-Akt1軸可能是PD治療中circSV2b過表達的關鍵靶點，并強調了血清外泌體中circSV2b的顯著變化。因此，circSV2b可能是PD診斷和治療的生物標記物。本文于2022年8月發表于“Redox Biology”（IF=10.787）上。

技術路線

結果

1）MPTP成功誘導小鼠PD的發生

我們連續5天腹腔注射MPTP溶液，以建立PD小鼠模型。MPTP降低了STR中DA及其代謝物（DOPAC和HVA）的水平（圖1A-C）。爬桿實驗和步態分析均表明，MPTP治療會損害小鼠的運動平衡（圖1D-F）。MPTP治療降低了SNpc和STR中TH的表達，并損傷了多巴胺能神經元（圖1G-J）。這些結果表明，MPTP減弱多巴胺合成，破壞黑質紋狀體功能，并誘發PD的運動癥狀。

2）MPTP誘導的PD小鼠的circRNA譜分析

RNA測序分析表明，在PD小鼠中發現8個上調和25個下調的circRNAs（圖2A）。這33個circRNAs在STR組織中的存在通過qRT-PCR進行了驗證。結果表明，在25個下調的circRNAs中，14個下調，8個上調，2個不變，1個未檢測到；在8個上調的circRNA中，5個上調，2個下調，1個未檢測到（圖2B）。在SNpc和血清外泌體中評估了19個RNA-seq數據(STR中)與qRT-PCR結果(STR中)一致的circRNAs(圖2C)。CircRNA#3，即circSV2b，其RNA測序（STR中）和qRT-PCR驗證（STR、SNpc和血清中）結果一致，被選為本研究的目標（圖2C）。FISH進一步證實，MPTP處理后，SNpc和STR中的circSV2b表達下調（圖2D）。CircSV2b來源于小鼠chr7（qD1）上的SV2b基因，由外顯子5–9在轉錄后通過頭尾剪接形成（圖2E）。此外，我們設計了SV2b mRNA的收斂引物和擴增circSV2b的特殊發散引物。我們在cDNA中檢測到一個320 bp的circv2b產物，在提取的gDNA中檢測到一個950 bp的產物(圖2F)。我們使用RNase R來驗證circSV2b的穩定性，發現circSV2b對RNase R消化有抵抗力（圖2G）。我們通過Sanger測序證實了circSV2b RT-PCR產物中circSV2b的頭尾拼接（圖2H）。

3）過表達circSV2b改善MPTP誘導的小鼠PD癥狀

我們評估了circSV2b過表達對PD的保護作用。注射AAV導致circSV2b過表達，并且在MPTP治療后，circSV2表達仍然很高（圖3A）。爬桿實驗和步態分析都表明，circSV2b的過表達減輕了受損的運動平衡（圖3B）。circSV2b過表達部分恢復了SNpc和STR中MPTP誘導降低的DA水平和TH蛋白水平（圖3C-E）。circSV2b過表達也逆轉了SNpc中TH+神經元數量和STR TH+纖維密度的減少（圖3F和G）。這些結果表明，circSV2b過表達可恢復多巴胺合成，維持黑質紋狀體功能，并改善MPTP誘導的PD小鼠的運動功能。

4）circSV2b通過ceRNA機制發揮作用

為了探索circSV2b的亞細胞定位，我們使用N2A細胞進行FISH染色，并證明circSV2位于N2A細胞的細胞質中（圖4A）。然后我們在組織水平上進行了測試。結果表明，circSV2b主要位于SNpc的細胞質中，MPTP處理導致細胞質circSV2b顯著減少（圖4B）。為了證明circSV2b與AGO2的結合作用，我們進行了熒光共標記實驗。結果表明，circSV2b和AGO2共定位（圖4C）。我們分析了3種circRNA-miRNA預測工具（miRanda、TargetScan和RNAhybrid）的重疊結果，確定了13種miRNAs（圖4D）。miRTarBase工具用于預測miRNA靶基因；只有3個候選miRNAs具有下游靶基因（圖4E）。我們比較了MPTP治療后SNpc組織中候選miRNAs的水平。結果表明，與其他候選miRNAs相比，MPTP組miR-5107-5p的增加更為顯著（圖4F）。進一步使用抗AGO2抗體和circSV2b探針分別進行RIP和RNA下拉分析。抗AGO2抗體下拉了circSV2b（圖4G）。此外，miR-5107-5p存在時作用更為明顯（圖4G）。circSV2b探針拉下AGO2蛋白（圖4H）。上述結果表明，circSV2b作為miRNAs的分子海綿發揮作用。

因為之前的研究已經證實Foxk1是由lncRNA通過ceRNA機制調控的，所以在miR-5017-5p的預測靶基因中，Foxkl被選為下游分子。大多數circSV2b、miR-5107-5p和AGO2共同定位于細胞質中（圖4I）。我們還進行了熒光標記實驗，以評估miR-5107-5p和Foxk1的結合，發現這兩個分子在細胞質中共存（圖4J）。我們進一步使用Foxk1探針進行了RNA下拉分析，發現Foxkl和AGO2結合（圖4K）。為了證實生物信息學預測分析，對N2A細胞進行了雙熒光素酶報告分析。結果表明，轉染circSV2b-wt的熒光素酶活性在miR-5107-5p模擬物組中顯著降低，在miR-5107-5p抑制劑組中顯著升高（圖4L，M）。另外，轉染Foxk1-wt的熒光素酶活性在miR-5107-5p模擬物組中顯著降低，而在miR-5107-5p抑制劑組中升高（圖4N）。上述結果表明，circSV2b與miR-5107-5p相互作用，miR-5107-25p與mRNA Foxk1相互作用。

5）Foxk1是Akt1的轉錄因子

由于氧化應激在PD發病機制中的重要作用，我們使用CUT和Tag-seq篩選與Foxk1下游氧化應激相關的靶基因。我們對對峰值相關基因進行了GO注釋和富集分析（圖5A和B）。兩個樣本都富含“氧化應激反應”。在該GO項目中，選擇Akt1的峰值檢測結果進行可視化；2個樣品中的相應峰非常接近Akt1的TTS（圖5C）。我們比較了靶峰序列和Foxk1基序，發現它們是一致的（圖5D）。

6）circSV2b調節miR-5107-5p的表達，miR-5107-25p影響Foxk1的表達，Foxkl影響Akt1的表達

為了進一步探索ceRNA-Akt1的調節作用，我們使用N2A細胞進行了基因編輯實驗。在circSV2b過表達后，miR-5107-5p和Foxk1的表達分別下調和上調（圖6A）。WB分析顯示，在circSV2b過表達后，Foxk1和Akt1均上調（圖6B和C）。我們設計了3個circSV2b干擾質粒。qRT-PCR結果證實shRNA1的干擾作用最為顯著（圖6D）。qRT-PCR還顯示，在circSV2b干擾后，miR-5107-5p和Foxk1表達分別上調和下調（圖6E）。WB分析顯示，在circSV2b干擾后，Foxk1和Akt1均下調（圖6F和G）。miR-5107-5p模擬物轉染后，Foxk1和Akt1 mRNA和蛋白表達下調（圖7A-C）。miR-5107-5p抑制劑的轉染上調了Foxk1和Akt1 mRNA和蛋白表達（圖7D-F）。我們設計了一個Foxk1過表達質粒。WB結果表明Foxk1成功過表達，Akt1表達上調（圖7G和H）。我們設計了3個Foxk1干擾質粒。WB結果表明，shRNA3的干擾效果最好（圖7I和J）。在Foxk1干擾后，Foxkl和Akt1的表達均下調（圖7K和L）。

7）circSV2b過表達通過ceRNA-Akt1途徑緩解PD中的氧化應激損傷

為了探索circSV2b過表達抵抗PD的機制，我們在AAV注射21天后使用MPTP建立PD小鼠模型。我們評估了ceRNA-Akt1通路中各種分子和氧化應激分子的表達變化。結果表明，circSV2b過表達逆轉了MPTP引起的miR-5107-5p的增加，并減輕了Foxk1和Akt mRNA和蛋白表達的減少（圖8A和B）。CircSV2b過表達降低了MPTP引起的氧化產物MDA的增加（圖8C），也提高了抗氧化酶（SOD和GSH-PX）的活性（圖8D）。如圖9所示，我們的研究結果表明，在MPTP條件下，circSV2b過表達可防止多巴胺能神經元的神經變性和SNpc的氧化應激損傷。PD中circSV2b過表達的神經保護作用可能主要由miR-5107-5p-Foxk1-cAkt1軸介導。此外，circSV2b可以通過外泌體轉運到外周血，其水平變化可以在PD模型的血清外泌體中檢測到。總之，我們證明了circSV2b可以作為PD診斷的生物標記物。此外，circSV2-b過表達的良好神經保護作用使其成為PD治療的一個很有前景的靶點。

結論：

circSV2b過表達通過miR-5107-5p-Foxk1-Akt1信號通路減少氧化應激損傷，保護多巴胺能神經元免受損傷，維持黑質紋狀體功能，改善運動障礙。血清外泌體中也可檢測到circSV2b的顯著變化。因此，circSV2b是PD治療的理想候選藥物，有助于更好地了解PD的發病機制。它還可以作為外周血檢測的分子標記物。

參考文獻：

Cheng Q, Wang J, Li M, Fang J, Ding H, Meng J, Zhang J, Fang X, Liu H, Ma C, Chen C, Zhang W. CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease. Redox Biol. 2022 Aug 12;56:102430. doi: 10.1016/j.redox.2022.102430.