盡管gemcitabine已被認(rèn)為是晚期胰腺癌（PC）的第一個線藥物，但對gemcitabine耐藥的發(fā)展嚴(yán)重限制了這種化療的有效性，gemcitabine耐藥的潛在機(jī)制仍不清楚。本研究從體內(nèi)和體外兩個方面探討了PC抵抗gemcitabine的microRNAs和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)信號通路的潛在機(jī)制。結(jié)果表明，hsa?miR?3178通過RhoB/PI3K/Akt信號通路?介導(dǎo)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上調(diào)促進(jìn)gemcitabine耐藥。這些發(fā)現(xiàn)提示hsa?miR?3178可能是克服PC中g(shù)emcitabine耐藥的新的治療靶點(diǎn)。本研究于2022年5月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. P?gp、BCRP和MRP1蛋白在gemcitabine耐藥的PC組織和細(xì)胞中過表達(dá)

有大量的研究表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在PC的化學(xué)治療中起著重要的作用。在本研究中，通過IHC staining進(jìn)一步證實了與gemcitabine敏感組織相比，P?gp（P糖蛋白）、BCRP（C反應(yīng)蛋白）和MRP1（多藥耐藥相關(guān)蛋白）在gemcitabine耐藥的PC組織和細(xì)胞中過表達(dá)（圖1A）。Western bloting檢測進(jìn)一步說明它們在gemcitabine耐藥的PANC-1-GEM 細(xì)胞中的表達(dá)更高（圖1B）。與胰腺上正常的組織相比，胰腺癌組織中P?gp（P-糖蛋白）、BCRP（C反應(yīng)蛋白）和MRP1（多藥耐藥相關(guān)蛋白）的表達(dá)水平上調(diào)（圖1I-N）。根據(jù)TCGA和GTE-x數(shù)據(jù)庫分析，得出與正常的組織相比，癌變組織中P?gp、BCRP和MRP1的mRNA水平也上調(diào)（圖O-Q）。作者通過Molecular docking simulation分析，暗示Gemcitabine與P?gp、BCRP和MRP1之間具有很強(qiáng)的結(jié)合能力（圖1C-H）。

圖1 P-gp、BCRP和MRP1在gemcitabine耐藥的胰腺癌組織和細(xì)胞中過表達(dá)。Gemcitabine與P-gp、BCRP和MRP1蛋白之間都具有很強(qiáng)的結(jié)合能力

2.  hsa?miR?3178過表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)外PANC?1細(xì)胞gemcitabine耐藥

作者先前的研究發(fā)現(xiàn)PC組織中has-miR-3178過表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)。為查清hsa-miR-3178在PC的gemcitabine耐藥中發(fā)揮的作用，作者進(jìn)行qRT-PCR實驗，與健康的人胰腺上皮細(xì)胞（HPDE6-C7）或鄰近的非癌變組織相比，七個胰腺癌細(xì)胞系（AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、Hs766t、PANC-1、MIA PaCa2和SW1990）和PC組織中hsa-miR-3178下調(diào)，結(jié)果如圖2A-C所示。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與gemcitabine耐藥PANC-1細(xì)胞相比，gemcitabine敏感的PANC-1-GEM細(xì)胞中hsa?miR?3178過表達(dá)（圖2D）。圖2E表明在PANC-1細(xì)胞中，與對照組相比，hsa-miR-3178 mimics增加gemcitabine的IC50增加。

CCK-8和Edu檢測發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)hsa-miR-3178表達(dá)的PANC-1細(xì)胞通過增加細(xì)胞增殖能力展示了對gemcitabine顯著抗性（圖2F，G）。作者們通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了hsa-miR-3178 mimics組的細(xì)胞凋亡百分比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組（圖2H）。最后，作者又構(gòu)建了BALB/c裸鼠移植瘤模型證實這一結(jié)論（圖2I-K），hsa?miR?3178過表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)外的PANC?1細(xì)胞gemcitabine耐藥。

圖2 hsa?miR?3178過表達(dá)促進(jìn)PANC?1細(xì)胞增殖和gemcitabine耐藥

3.  下調(diào)hsa?miR?3178抑制體內(nèi)外PANC?1?GEM細(xì)胞增殖和增強(qiáng)細(xì)胞對gemcitabine的敏感性

作者通過轉(zhuǎn)染hsa-miR-3178 inhibiting vector至PANC-1-GEM細(xì)胞來探索hsa-miR-3178在體內(nèi)藥物治療中發(fā)揮的作用。轉(zhuǎn)染hsa-miR-3178 inhibiting vector后，PANC-1-GEM細(xì)胞中g(shù)emcitabine的IC50值比未轉(zhuǎn)染的顯著減小（圖3A）。CCK-8和Edu檢測發(fā)現(xiàn)hsa-miR-3178表達(dá)下調(diào)的PANC-1-GEM細(xì)胞增殖能力顯著提升，并且增強(qiáng)對gemcitabine的敏感性（圖3B，C）。作者采用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染hsa-miR-3178mimics的PANC-1-GEM細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染hsa-miR-3178 inhibiting vector的PANC-1-GEM細(xì)胞凋亡數(shù)量增多（圖3D）。

   作者分別轉(zhuǎn)染antagomir-3178和antagomir陰性對照的BALB/c裸鼠建立了體外移植瘤模型，表明antagomir-3178顯著減少移植瘤的重量，并且gemcitabine治療后顯著減緩腫瘤的生長（圖3E-G）。

圖3 下調(diào)hsa?miR?3178抑制體內(nèi)外PANC?1?GEM細(xì)胞增殖和增強(qiáng)細(xì)胞對gemcitabine的敏感性

4. RhoB是hsa?miR?3178的直接靶基因

作者采用四種生物信息學(xué)算法（miRWalk、miRanda、RNA22和Targescan），與來自gemcitabine耐藥數(shù)據(jù)集GSE80617的PANC-1-GEM細(xì)胞中的下調(diào)基因進(jìn)行交叉，得到了RhoB和HIST2H2BE兩個基因。通過文獻(xiàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)RhoB具有胰腺癌促進(jìn)因子的生物學(xué)功能。于是作者查找TCGA數(shù)據(jù)庫中PC病人的RhoB和hsa-miR-3178的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RhoB的表達(dá)與hsa-miR-3178呈負(fù)相關(guān)（圖4A）。Western blotting檢測分別導(dǎo)入hsa-miR-3178 mimics的PANC-1細(xì)胞和導(dǎo)入hsa-miR-3178 inhibitor的PANC-1-GEM細(xì)胞，結(jié)果表明上調(diào)hsa-miR-3178抑制RhoB的表達(dá)，下調(diào)hsa-miR-3178促進(jìn)RhoB的表達(dá)（圖4B）。作者構(gòu)建hsa-miR-3178 mimics、mimics NC和RhoB的野生型3 ' -UTR和突變型3 ' -UTR質(zhì)粒（圖4C），雙熒光素酶實驗結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染has-miR-3178 mimics質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒，與轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒相比，熒光素酶活性顯著降低（圖4D）。這些結(jié)果提示，hsa-miR-3178可能通過直接靶向RhoB的3 ' -UTR來抑制RhoB的表達(dá)。作者對含有87例PC組織芯片進(jìn)行IHC檢測，實驗示意圖如圖4E所示，Kaplan - Meier survival分析顯示RhoB過表達(dá)與病人有一個良好的總生存期顯著相關(guān)（圖4F）。因此，RhoB是hsa?miR?3178的直接靶基因。

圖4 RhoB是hsa?miR?3178的直接靶基因

5.   RhoB逆轉(zhuǎn)hsa?miR?3178介導(dǎo)的PC細(xì)胞和親本PANC-1細(xì)胞的gemcitabine耐藥性

為探索hsa?miR?3178在PC細(xì)胞增殖和gemcitabine耐藥中對RhoB的抑制作用。作者在PANC-1細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染RhoB過表達(dá)的慢病毒和hsa-miR-3178 mimics，或在PANC-1-GEM細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染RhoB siRNA和hsa-miR-3178 inhibitor。

RhoB上調(diào)可降低PANC-1細(xì)胞對gemcitabine的IC50，逆轉(zhuǎn)has-miR-3178介導(dǎo)的PANC-1細(xì)胞gemcitabine耐藥（圖5A）。CCK-8和EdU assay的結(jié)果揭示RhoB過表達(dá)減少PANC-1細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)PANC-1細(xì)胞中hsa-miR-3178對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用（圖5B-C）。過表達(dá)RhoB可促進(jìn)PANC-1細(xì)胞凋亡，也能拮抗hsa-miR-3178對PANC-1細(xì)胞凋亡的抑制作用（圖5D）。圖5A-D是共轉(zhuǎn)染RhoB過表達(dá)的慢病毒和hsa-miR-3178 mimics的相關(guān)結(jié)果；圖6A-D是在PANC-1-GEM細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染RhoB siRNA和hsa-miR-3178 inhibitor相應(yīng)的結(jié)果。兩種方法分別從上調(diào)和下調(diào)兩個角度闡述RhoB逆轉(zhuǎn)PAN -1細(xì)胞中hsa- miR-3178介導(dǎo)的增殖和gemcitabine耐藥。

圖5 RhoB逆轉(zhuǎn)PAN -1細(xì)胞中hsa- miR-3178介導(dǎo)的增殖和gemcitabine耐藥。

圖6 RhoB逆轉(zhuǎn)hsa-miR-3178介導(dǎo)的增殖和PANC-1-GEM細(xì)胞中gemcitabine耐藥。在PANC-1-GEM細(xì)胞中，siRhoB與hsa-miR-3178 inhibitor共轉(zhuǎn)染。

6.   hsa?miR?3178/RhoB軸通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白管理gemcitabine耐藥

作者進(jìn)行Western blotting結(jié)果分析，探索參與蛋白表達(dá)的PANC-1細(xì)胞和指定處理生物PANC-1-GEM細(xì)胞的PI3K/Akt信號通路。RhoB過表達(dá)PANC-1細(xì)胞中PI3K和Akt的總表達(dá)不受影響，但減低p-PI3K、p-Akt 308 和p-Akt 473的磷酸化（圖7A）。共轉(zhuǎn)染RhoB和has-miR-3178 mimics降低hsa-miR-3178對PANC-1細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt 308和p-Akt 473的表達(dá)。反之，RhoB敲低可增加p-PI3K、p-Akt 308和p-Akt 473的表達(dá)，siRhoB與hsa-miR-3178 inhibitor共轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)PANC-1-GEM 細(xì)胞中hsa-miR-3178 inhibitor下調(diào)p-Akt 308和p-Akt 473的表達(dá)（圖7B）。為進(jìn)一步證實PI3K/Akt信號通路通過hsa-miR-3178/RhoB軸調(diào)控PC細(xì)胞增殖和gemcitabine耐藥的作用。用PI3K抑制劑LY294002和PI3K興奮劑740Y-P孵育PANC-1細(xì)胞和PANC-1-gem細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)PANC-1細(xì)胞中PI3K inhibitor抑制hsa-miR-3178過表達(dá)對p-PI3K、p-Akt 308和p-Akt 473的刺激作用（圖7C）。相反，在PANC-1-GEM細(xì)胞中，下調(diào)的hsa-miR-3178對p-PI3K、p-Akt308和p-Akt473的抑制作用被PI3K興奮劑逆轉(zhuǎn)（圖7D）。此外，has-miR-3178過表達(dá)的PANC-1細(xì)胞在體外和體內(nèi)中上調(diào)P-gp、BCRP和MRP1的表達(dá)（圖7E），而hsa-miR-3178抑制劑下調(diào)體內(nèi)外P-gp、BCRP和MRP1的表達(dá)（圖7F）。因此，hsa?miR?3178/RhoB軸通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白管理gemcitabine耐藥。

圖7 hsa?miR?3178/RhoB軸通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白管理gemcitabine耐藥

圖8 本研究機(jī)制圖

結(jié)論

總之，這項研究表明hsa-miR-3178/RhoB/PI3K/Akt介導(dǎo)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上調(diào)在誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞gemcitabine耐藥中發(fā)揮重要作用（圖8）。靶向Hsa-Mir-3178/RhoB可能代表了一種潛在的治療策略來規(guī)避ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的gemcitabine耐藥用于PC治療。

參考文獻(xiàn)

Gu J, Huang W, Wang X, Zhang J, Tao T, Zheng Y, Liu S, Yang J, Chen ZS, Cai CY, Li J, Wang H, Fan Y.(2022) Hsa-miR-3178/RhoB/PI3K/Akt, a novel signaling pathway regulates ABC transporters to reverse gemcitabine resistance in pancreatic cancer. Mol Cancer. 21(1):112. doi: 10.1186/s12943-022-01587-9.