廣泛轉移導致卵巢癌的高死亡率，了解其分子機制有助于找到轉移性卵巢癌治療的有效靶點。已發現PLAA在一些癌癥中失活，但其在癌癥轉移中的作用尚不清楚。在此，我們發現PLAA在卵巢癌高轉移細胞系和患者中顯著下調，PLAA的低表達與患者的預后差和高危臨床病理特征相關。在原位異種移植小鼠模型中，PLAA抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲和移植瘤的轉移。同時，PLAA通過抑制TRPC3介導的細胞內Ca2+水平來抑制卵巢癌的轉移。從機制上講，PLAA通過泛素介導的降解抑制METTL3的表達，而METTL3 mRNA通過m6A修飾穩定TRPC3 mRNA的表達。我們的研究證實了PLAA-METTL3-TRPC3軸參與卵巢癌轉移的功能和機制，以期為卵巢癌提供潛在的治療途徑。本文于2022年7月發表于“Oncogene”（IF=8.756）上。

技術路線

結果

1）卵巢癌中PLAA下調，與預后呈正相關

通過LC-MS/MS分析，PLAA被確定為高轉移細胞中最顯著下調的蛋白質之一（圖1A）。PLAA的典型質譜如圖1B所示。通過western blot和RT-qPCR驗證了PLAA在具有不同轉移能力的卵巢癌細胞系（包括A2780-M、A2780、HO8910PM、HO8910）和正常卵巢上皮細胞系IOSE-80中的內源性表達。結果表明，高轉移細胞系的PLAA低于親代細胞系，卵巢癌細胞的PLAA也低于正常卵巢細胞（圖1C、D）。我們還收集了56例卵巢癌新鮮組織樣本和12例卵巢良性腫瘤新鮮組織樣本進行PLAA mRNA檢測，發現癌組織中PLAA mRNA顯著降低（圖1E）。此外，卵巢癌組織中PLAA蛋白的表達顯著低于良性腫瘤組織（圖1F）。有趣的是，與原發性卵巢癌相比，轉移性卵巢腫瘤中PLAA蛋白和mRNA的表達進一步降低（圖1G）。為了了解PLAA的臨床意義，我們收集了79例卵巢癌患者的臨床病理資料以及他們的組織樣本，并進行了免疫組化分析（圖1H）。Kaplan-Meier生存分析所示，低PLAA表達患者的無進展生存期也比高PLAA表達的患者短（圖1I）。我們還分析了TCGA數據庫中的數據，發現了相同的結果（圖1J）。我們的數據表明，低PLAA表達的患者生存期較短，PLAA可能是預測卵巢癌預后的潛在生物標記物。

2）PLAA在體內外抑制卵巢癌的遷移和侵襲

為了證實PLAA在卵巢癌中的生物學功能，建立了PLAA敲低或PLAA過表達細胞系（圖2A-D）。我們發現PLAA過表達顯著抑制細胞遷移和侵襲（圖2E，F），而PLAA下調促進細胞遷移和侵襲（圖2G，H）。接下來，我們利用原位異種移植模型研究了PLAA對卵巢癌體內轉移的影響。將A2780-M-PLAA-luc或A2780-M對照-luc細胞原位注射到卵巢上皮下（圖2I）。每周使用體內成像系統（IVIS）監測腫瘤進展，6周后對小鼠實施安樂死。通過摘除原發腫瘤分別評估原發腫瘤和轉移腫瘤（圖2J）。IVIS掃描顯示，與對照組相比，PLAA過表達顯著抑制了異種移植模型的轉移，而不會改變其原發腫瘤（圖2K）。H&E染色顯示卵巢癌原發腫瘤、網膜和腸轉移的典型形態（圖2L）。免疫組織化學染色分析顯示PLAA在原位異種移植模型中的過表達效率（圖2M）。我們的研究結果表明，PLAA在卵巢癌中起到了腫瘤轉移抑制作用。

3）TRPC3與PLAA表達呈負相關

為了了解PLAA抑制卵巢癌轉移的潛在機制，分別對有PLAA下調和無PLAA下調的A2780細胞進行轉錄組測序。分層聚類表明，PLAA敲低的細胞中有165個上調基因和109個下調基因（圖3A）。我們選擇了10個上調和10個下調基因，以驗證它們在PLAA敲低的A2780和HO8910細胞中的表達，或在PLAA過表達的A2780-M和HO8910PM細胞中的表達，并發現在這些差異表達的基因中，TRPC3是唯一在兩種細胞中以及兩個PLAA siRNA中持續上調表達的基因（圖3B）。相反，在PLAA過表達的A2780-M和HO8910PM細胞中，TRPC3下調（圖3C）。此外，經驗證，TRPC3蛋白表達在PLAA敲除時上調（圖3D），在PLAA過表達時下調（圖3E），以及與親代細胞相比在高轉移細胞中下調（圖3G）。我們進一步發現56例癌癥樣本中PLAA和TRPC3 mRNA的表達呈顯著負相關（圖3G），IHC染色分析也顯示PLAA和TRPC3呈負相關（圖3H）。因此，這些結果證實TRPC3可能是卵巢癌中PLAA的潛在靶點。

4）TRPC3是一個癌基因，是PLAA的下游靶點

為了進一步明確TRPC3在卵巢癌中的作用，我們首先檢測了臨床卵巢癌樣本中TRPC3的表達。我們證實，與良性卵巢腫瘤組織相比，卵巢癌組織中的TRPC3 mRNA顯著上調（圖4A），并且在卵巢癌組織的晚期比早期更高（圖4B）。此外，TCGA數據庫的Kaplan–Meier生存分析表明，較高的TRPC3表達與較短的無進展生存期相關（圖4C）。因此，我們根據TRPC3的基本水平建立了TRPC3敲除或TRPC3過表達的細胞模型，并發現無論TRPC3被敲除或過表達，PLAA表達都保持不變（圖4D，E），但transwell分析顯示TRPC3敲低或用TRPC3抑制劑Pyr3治療，抑制A2780-M和HO8910PM細胞的遷移和侵襲（圖4F，G）。此外，我們還觀察到，PLAA過表達導致的遷移和侵襲能力下降可通過TRPC3過表達恢復（圖4H）。相反，TRPC3 siRNA或Pyr3處理可消除PLAA敲除加速的遷移和侵襲能力（圖4I）。此外，我們發現，與對照組相比，注射A2780-shPLAA-luc的小鼠表現出更廣泛的轉移，通過Pyr3治療可以顯著消除轉移，但在原發腫瘤中未檢測到顯著變化（圖4J）。我們的結果表明，PLAA以TRPC3依賴的方式抑制卵巢癌轉移。

5）PLAA通過降低TRPC3介導的細胞內鈣水平抑制卵巢癌轉移

TRPC3是一種控制鈣相關信號的高鈣滲透性陽離子通道。細胞內鈣是一種多功能的第二信使，參與多種生物學行為，如癌細胞的增殖和轉移。在含有1.8 mM游離鈣的外部溶液中，我們觀察到當TRPC3被敲低或用Pyr3處理時，細胞內Ca2+水平降低（圖5A、B）。相反，當TRPC3過表達時，細胞內Ca2+水平增加，并且通過BAPTA-AM（一種公認的細胞內鈣螯合劑）治療恢復增加的Ca2+水平（圖5C）。我們進一步觀察了鈣內流對TRPC3促進卵巢癌轉移的作用。正如預期的那樣，我們發現在經BAPTA-AM處理的A2780和HO8910細胞中，TRPC3過表達促進的遷移和侵襲被消除（圖5D）。此外，IVIS掃描顯示，與對照組相比，Pyr3或BAPTA-AM治療的異種移植模型的轉移受到明顯抑制，但在原發腫瘤中未檢測到明顯變化（圖5E）。此外，在含有1.8 mM游離鈣的外部溶液中，我們發現TRPC3下調或BAPTA-AM處理顯著降低了PLAA下調引起的細胞內Ca2+水平的升高（圖5F）。正如預期的那樣，BAPTA-AM也挽救了PLAA下調促進的遷移和侵襲（圖5G）。我們的結果表明，PLAA通過下調TRPC3介導的細胞內鈣水平抑制卵巢癌轉移。

6）PLAA通過m6A修飾破壞TRPC3 mRNA的穩定性

如上所述，PLAA可以直接調節TRPC3 mRNA水平。在此，我們發現PLAA敲低顯著增加了TRPC3 mRNA的穩定性（圖6A），而PLAA過表達發揮了相反的作用（圖6B）。考慮到m6A修飾是mRNA在轉錄后水平的常見調節模型，包括mRNA穩定性。首先，我們敲低METTL3，并發現A2780和HO8910細胞中的TRPC3 m6A修飾水平（圖6C）、mRNA穩定性（圖6D）、mRNA水平（圖5E）和蛋白質水平（補充圖）顯著降低。為了進一步證明m6A在調節TRPC3中的重要作用，我們建立了一個抗m6A修飾的突變TRPC3（圖6F），并發現當METTL3沉默時，在轉染TRPC3-WT質粒的細胞中，熒光素酶活性降低（圖6G）。此外，為了研究PLAA是否通過m6A修飾介導TRPC3，我們進行了拯救試驗，發現由PLAA缺失引起的m6A修改水平升高和TRPC3 mRNA半衰期延長被METTL3敲除所逆轉（圖6H，I）。此外，通過METTL3的衰減也可以恢復PLAA敲除誘導的TRPC3 mRNA和蛋白水平的升高（圖6J，K）。我們的結果表明，PLAA通過m6A修飾調節TRPC3 mRNA的表達。

7）PLAA通過泛素介導途徑促進卵巢癌METTL3降解

由于PLAA通過m6A修飾來調節TRPC3 mRNA的表達，因此我們檢測了m6A修飾的相關蛋白。我們發現在PLAA敲低的細胞中，METTL3顯著升高（圖7A），這表明TRPC3 mRNA受METTL3.調節。此外，RNA免疫沉淀分析表明，與IgG對照組相比，METTL3特異性抗體顯著富集了TRPC3 mRNA，而PLAA的敲除顯著增強了A2780和HO8910細胞中TRPC3的mRNA富集（圖7B）。考慮到PLAA下調對METTL3的mRNA水平沒有影響（圖7C），我們認為蛋白水平的變化可能是PLAA下調組METTL3mRNA上調的主要原因。因此，我們用環己酰亞胺（CHX）處理A2780和HO8910細胞以抑制蛋白質生物合成，并發現在PLAA敲除的細胞中METTL3蛋白的半衰期顯著延長（圖7D）。我們進一步觀察到蛋白酶體抑制劑MG132治療后，PLAA過表達的A2780-M和HO8910PM細胞中METTL3蛋白表達恢復（圖7E）。這些結果表明METTL3是通過泛素介導的降解途徑降解的。因此，我們進行泛素化實驗，發現PLAA下調減少了A2780和HO8910細胞中METTL3的泛素化（圖7F）。這些結果表明，PLAA通過泛素介導的降解途徑抑制METTL3蛋白的表達。

結論：

我們的研究表明，下調的PLAA與卵巢癌轉移和患者預后不良相關，PLAA通過調節TRPC3和細胞內鈣水平抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲，并抑制小鼠原位異種移植的轉移。PLAA通過蛋白酶體降解途徑下調METTL3，METTL3-介導的m6A修飾有助于PLAA調節TRPC3 mRNA。我們的研究結果表明PLAA在卵巢癌轉移中的抑制作用以及潛在機制，這可能為臨床阻斷卵巢癌轉移提供一種潛在的途徑。

參考文獻：

Shen Z, Gu L, Liu Y, Wang L, Zhu J, Tang S, Wei X, Wang J, Zhang S, Wang X, Cheng X, Xie X, Lu W. PLAA suppresses ovarian cancer metastasis via METTL3-mediated m6A modification of TRPC3 mRNA. Oncogene. 2022 Aug;41(35):4145-4158. doi: 10.1038/s41388-022-02411-w.