紫杉醇是治療非小細胞肺癌的主要手段，其耐藥性嚴重影響病患的生存。然而，其內在機制和潛在的反轉策略還需要進一步探索。本研究探討了ALDH2在非小細胞肺癌PTX的耐藥中的功能作用、臨床意義及異常調控機制。并通過一系列研究證明了ALDH2能幫助預測病患對PTX治療的反應，ALDH2抑制在臨床上是一種克服PTX耐藥的有前途的策略。本研究于2022年4月發表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技術路線：

主要研究結果：

1.        ALDH2在NSCLC細胞中被鑒定為紫杉醇耐藥相關基因。

作者對NCI-H460和NCI-H460/PTX細胞進行了基因芯片分析，研究差異表達的基因。通路分析顯示，與莖干和耐藥相關的通路顯著富集，表明在肺癌中，莖干的變化包含在PTX的耐藥中（圖1A）。接下來，作者進一步分析了NSCLC細胞和NSCLC/PTX細胞的生物學特征?？寺⌒纬蓪嶒?、球體形成實驗和Transwell遷移實驗表明NSCLC/PTX細胞的自我更新和遷移的能力比NSCLC細胞更強（圖1B）。以上所有結果表明，NSCLC/PTX細胞的生物樣特征增強。然后，作者分析了干細胞轉錄因子的蛋白表達。結果表明Sox2、Nanog和Oct4在NSCLC/PTX細胞中的表達比在NSCLC細胞中的更高（圖1C）。

作者發現，在NSCLC/PTX細胞中ALDH活性明顯高于NSCLC細胞（圖1D）。在ALDH亞型中，ALDH2在NSCLC/PTX細胞中的蛋白表達高于NSCLC（圖1E）。作者利用CCLE和GDSC數據庫分析ALDH2與肺癌PTX之間的關系。結果表明，ALDH2的表達水平與對PTX的敏感性線性相關。ALDH2表達水平越高，細胞對PTX的敏感性越低（圖1F）。作者測定了46例NSCLC患者PTX治療后組織標本中ALDH2的表達水平，證實ALDH2與NSCLC患者PTX敏感性的關系。結果表明，與低ALDH2組相比，ALDH2蛋白高表達水平與整體存活率差顯著相關（圖1G）。綜上所述，ALDH2在NSCLC細胞的成莖特性積累和PTX耐藥過程中起重要作用。

圖1非小細胞肺癌紫杉醇耐藥相關基因ALDH2的鑒定

2.    當ALDH2在NSCLC細胞中受到藥物抑制劑或基因干預時，PTX的療效會發生改變。

作者敲低ALDH2后NSCLC/PTX細胞中PTX的療效顯著升高，而過表達ALDH2的NSCLC細胞中PTX的療效顯著降低（圖2A-B）。作者敲除ALDH2后，NSCLC/PTX細胞遷移和自我更新能力明顯下降（圖2C）。過表達ALDH2后NSCLC細胞的遷移和自我更新能力明顯增強（圖2D）。ALDH2特異性抑制劑DZN在非細胞毒性濃度下顯著抑制NSCLC/PTX細胞中ALDH活性。此外，在非細胞毒性濃度下，DZN聯合PTX可顯著增加NSCLC/PTX細胞對PTX的敏感性（圖2E）。作者暫時沉默ALDH2和其他CSCs相關的ALDH亞型（ALDH1A1和ALDH3A1），并測定NSCLC/PTX細胞對PTX的敏感性。結果表明，其他ALDH亞型的瞬時沉默對PTX敏感性無顯著影響。但當ALDH2瞬時沉默后，NSCLC/PTX細胞對PTX的敏感性明顯增強（圖2F）。綜合以上結果，說明ALDH2是與PTX耐藥相關的重要ALDH亞型。

研究通過慢病毒轉染，分別建立了單獨表達熒光素酶（空載體組）或熒光素酶+ ALDH2（ALDH2過表達組）的NCI-H1299和NCI-H460細胞。然后通過尾靜脈注射Balb/c-nu小鼠細胞。結果表明，注射ALDH2過表達細胞的小鼠肺、腦和骨轉移率均高于空載體組（圖2G）。此外，體內數據顯示，ALDH2過表達的NCI-H1299異種移植瘤對PTX的耐藥性（抑制率39.36%）高于未過表達ALDH2的NCI-H1299異種移植瘤（抑制率53.19 %）（圖2H）。同樣，在NCIH460異種移植瘤模型中也得出了此結論。綜合以上結果，說明ALDH2與體內PTX耐藥有關。

圖2當ALDH2通過藥物或基因干預調控NSCLC細胞時，PTX的療效會發生改變。

3.      NFYA轉錄因子參與ALDH2轉錄的激活。

作者們分析了ALDH2的啟動子區域，并根據PROMO、JASPAR等生物信息學數據庫預測了轉錄因子結合位點。結果發現轉錄因子NFYA和HNF4A存在多個結合位點（圖3A）。接下來，作者們采用雙熒光素酶報告基因檢測方法測定NSCLC和NSCLC/PTX中的報告基因活性。在NSCLC細胞和NSCLC/PTX細胞中均見到類似的轉錄活性模式。其中包含一個NFYA結合位點的P3區在所檢測的4種細胞系中活性最高（圖3B）。這表明NFYA可能是ALDH2啟動子的轉錄激活因子。接下來，作者們測定了轉錄因子NFYA和HNF4A在NSCLC和NSCLC/PTX細胞中的蛋白表達水平。NSCLC/PTX細胞NFYA和HNF4A蛋白水平高于NSCLC細胞（圖3C）。進一步，作者們利用雙熒光素酶報告法研究了轉錄因子NFYA和HNF4A對ALDH2啟動子的調控能力。結果表明，在轉染過表達NFYA或HNF4A質粒的NSCLC和NSCLC/PTX細胞中，ALDH2啟動子活性明顯增強（圖3D）。這為這兩種轉錄因子在ALDH2轉錄調控中的關鍵作用提供了進一步的證據。

作者對ALDH2啟動子內的NFYA和HNF4A結合位點進行突變，構建了報告基因pGL3 - ALDH2 – NFYA - M1/M2和pGL3 - ALDH2 - HNF4AM1/M2/M3，并測定了這些報告基因在細胞中的轉錄活性。與其他啟動子突變質粒相比，pGL3 - ALDH2 - NFYA - M1在NSCLC/PTX細胞中的熒光素酶活性明顯降低，表明ALDH2啟動子的轉錄激活依賴于NFYA（圖3E）。接下來構建穩定敲低NFYA的NSCLC/PTX細胞，并測定了ALDH2蛋白水平。結果表明，ALDH2蛋白在這些細胞中的表達水平降低（圖3F）。此外，拯救NFYA表達時，ALDH2蛋白表達水平升高（圖3F）。為明確NFYA與ALDH2之間的關系，作者采用免疫組織化學方法檢測49例PTX治療的NSCLC患者組織標本中NFYA和ALDH2的表達水平。結果顯示，80 % NFYA高表達患者（n = 20）為高ALDH2表達組（n = 25），54 % NFYA低表達患者（n = 13）為低ALDH2表達組（n = 24）。由此可見，PTX治療NSCLC患者NFYA表達與ALDH2表達呈正相關（圖3G）。綜合以上結果，證明了NFYA是ALDH2重要的轉錄激活因子。

圖3 NFYA轉錄因子參與ALDH2轉錄的激活

4.      ALDH2的轉錄激活受NFYA和EHMT2的協作調控。

基因芯片結果顯示，與NSCLC細胞相比，NCI-H460/PTX細胞中一些表觀遺傳學酶的表達發生了改變（圖4A）。因此，作者測定了一系列表觀遺傳酶抑制劑處理的NSCLC/PTX細胞中ALDH2蛋白水平。結果表明，抑制EHMT2（組蛋白賴氨酸甲基轉移酶2）的UNC0638在NSCLC/PTX細胞和NSCLC細胞中明顯上調ALDH2（圖4B）。EHMT2增加H3K9me2水平，對轉錄有抑制作用。研究推測，當EHMT2被抑制時，ALDH2的表達會上調。作者們又測定了另外三種EHMT2抑制劑（UNC0638、UNC0642、UNC0631）和JMJD抑制劑JIB04處理的NSCLC/PTX細胞中ALDH2蛋白水平。結果發現EHMT2抑制劑上調ALDH2蛋白表達，JIB04具有下調作用（圖4C）。這些結果說明EHMT2和JMJD通過表觀遺傳學機制調控ALDH2。

作者們在UNC0638、UNCC0642和JIB04處理的NSCLC/PTX細胞中過表達NFYA。結果表明，當NFYA過表達或EHMT2被抑制時，ALDH2啟動子活性顯著升高；此外，NFYA過表達和EHMT2抑制共同作用于ALDH2的上調（圖4D-E）。然后，作者在NCI-H460和NCI-H460/PTX細胞中，繪制了兩個組蛋白標記（H3K9me2, Ac-H3）在全基因組的圖譜。結果表明，NCI-H460/PTX中H3K9me2峰活性染色質信號較低，Ac-H3峰活性染色質信號較高（圖4F）。此外，研究還驗證了與NCI-H460相比，NCIH460/PTX中ALDH2啟動子區H3K9me2的積累減少，而Ac-H3的積累則在ALDH2啟動子區（圖4G頂部和中部）增加。UNC0638處理的NCIH460細胞，NFYA與ALDH2啟動子的結合能力增強，而JIB04則相反（圖4G底）?？傮w而言，這些結果提示NFYA是ALDH2的重要轉錄激活因子，EHMT2和NFYA在ALDH2的調控中具有協同作用。

圖4 ALDH2的轉錄激活受NFYA和EHMT2的協作調控

5.      ALDH2通過RAS/RAF通路介導紫杉醇的耐藥性。

對轉染ALDH2或擾亂shRNA的NCI-H460/PTX細胞進行基因芯片分析，結果顯示，穩定敲除ALDH2后，NCI-H460/PTX細胞中有許多基因差異表達；其中，511個shALDH2與Scramble相比有所下降（圖5A）。與NCI-H460相比，NCI-H460/PTX上調基因間存在富集基因；與Scramble相比，ALDH2 shRNA轉染NCI-H460/PTX下調基因間存在富集基因（圖5B）。通路分析顯示TGF β通路、RAF通路、EMT通路等明顯富集（圖5C），表明這些通路可能參與ALDH2介導的肺癌PTX耐藥。接下來，作者們研究了RAS/RAF信號通路相關蛋白的表達情況，發現與Scramble組相比，ALDH2敲低的NSCLC/PTX細胞中RAS/RAF信號通路相關蛋白的表達水平持續下降（圖5D）。因此，我們推測RAS/RAF信號通路參與了ALDH2介導的紫杉醇耐藥。然后，作者們過表達KRAS和RAF1，并測定PTX在ALDH2敲除NSCLC/PTX細胞中的療效。結果表明，在ALDH2敲低的NSCLC/PTX細胞中過表達KRAS和RAF1后，PTX的療效下降（圖5E-F）。綜合以上結果，證明RAS/RAF信號通路參與了ALDH2介導的PTX抗性。

圖5 敲低ALDH2可抑制NSCLC/PTX細胞中的RAS/RAF通路

6.      ALDH2的藥理抑制使體內外的NSCLC/PTX細胞對紫杉醇敏感。

DZN是ALDH2的特異性抑制劑，DSF是ALDH2的非特異性抑制劑。為了驗證DZN + PTX或DSF + PTX對NSCLC/PTX細胞的生長抑制具有協同作用，作者采用NCI-H460/PTX異種移植模型，測定其體內靶向ALDH2的抑制效果（圖6A）。結果顯示，DZN + PTX組和DSF + PTX組腫瘤體積明顯小于PTX單獨組（圖6B-C）。DZN + PTX組腫瘤重量明顯低于單純PTX（圖6D）。這些結果表明，靶向抑制ALDH2逆轉了PTX抗性。TUNEL染色證實，與單純PTX相比，DZN + PTX和DSF + PTX顯著增加腫瘤組織細胞凋亡水平（圖6E）。此外，Western blot結果證實PTX聯合ALDH2抑制劑較單獨PTX能抑制Erk1/2和MEK1/2磷酸化（圖6F），免疫組化結果也證實PTX聯合ALDH2抑制劑較單獨PTX能抑制ERK1/2磷酸化（圖6G）。以上數據表明，DZN或DSF對ALDH2的藥理學抑制作用可通過誘導細胞凋亡和抑制RAS/RAF信號通路逆轉NCI-H460/PTX異種移植模型的PTX耐藥性。

圖6 DZN和DSF使體內NSCLC/PTX細胞中紫杉醇的耐藥顯著下降

7.      ALDH2的表觀遺傳下調使體內外NSCLC/PTX細胞中紫杉醇的耐藥性下降。

本實驗構建了NCI-H460/PTX異種移植瘤模型，研究JIB04和PTX聯合應用能否逆轉PTX耐藥（圖7A）。在本模型中，JIB04 + PTX組與PTX單獨組相比，明顯抑制了相對腫瘤體積和腫瘤重量（圖7B和C）。以上結果表明，JIB04與PTX合用，提高了PTX的抗腫瘤作用，逆轉了PTX的耐藥性。在NCI-H460/PTX腫瘤組織中，Western blot和免疫化學進一步證實JIB04下調ALDH2（圖7D和E）。TUNEL染色也證實JIB04 + PTX顯著增加腫瘤細胞的凋亡水平（圖7F）?？偟膩碚f，表明JIB04與PTX聯合誘導PTX耐藥的NSCLC移植瘤細胞凋亡。當用EHMT2抑制劑UNC0642替代DZN上調ALDH2表達時，腫瘤體積較其他兩組增大（圖7G）。綜上所述，ALDH2的表達可通過表觀遺傳學途徑調控，從而影響NSCLC對PTX的敏感性。

圖7 JIB04使體內NSCLC/PTX細胞中紫杉醇的耐藥顯著下降

圖8 研究結果圖

結論

本研究結果總結在一個示意圖（圖8）。抑制EHMT2和同時過表達NFYA可上調ALDH2的表達，該信號軸參與介導體內外對PTX的耐藥。從機制上講，NFYA是ALDH2重要的轉錄激活因子，EHMT2通過增加H3K9me2水平使染色質致密化。抑制EHMT2可促進NFYA與ALDH2啟動子結合，從而激活ALDH2的轉錄。DZN、DSF或JIB04抑制或下調ALDH2可增加PTX對NSCLC/PTX細胞或移植瘤的療效，逆轉PTX耐藥。本研究結果揭示了一種抑制或下調促瘤基因的新策略，可能為克服PTX耐藥提供了突破口。

參考文獻

Wang W, Wang J, Liu S, Ren Y, Wang J, Liu S, Cui W, Jia L, Tang X, Yang J, Wu C, Wang L. (2022). An EHMT2/NFYA-ALDH2 signaling axis modulates the RAF pathway to regulate paclitaxel resistance in lung cancer. Mol Cancer. 2022 Apr 27;21(1):106. doi: 10.1186/s12943-022-01579-9.