大量研究表明DNA甲基化改變與癌癥進(jìn)展之間的關(guān)系，但只有少數(shù)基因被證實(shí)可作為結(jié)直腸癌（CRC）的診斷生物標(biāo)志物。近日，有研究發(fā)現(xiàn)PDX1, EN2和MSX1的高甲基化可以預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，該研究發(fā)表在《Experimental & Molecular Medicine》，IF：12.125。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 通過靶向亞硫酸氫鹽測(cè)序鑒定CRC組織中的差異甲基化區(qū)域

為了觀察CRC和其他類型癌癥中的甲基化水平，從TCGA收集了5種癌癥類型（COAD、READ、LIHC、AD和PAAD）的微陣列數(shù)據(jù)（圖1a）。根據(jù)人類基因組ref. （hg19）將每個(gè)CpG位點(diǎn)的beta值取平均值，以代表其匹配的CpG島的甲基化值。根據(jù)一下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步過濾所選擇的CpG島：健康組織和腫瘤組織之間的甲基化值差異應(yīng)該大于20%； 20%的癌癥患者應(yīng)該存在這種差異。最終獲得了10,754個(gè)差異甲基化的CpG島（圖1b）。作者使用NimbleDesign軟件設(shè)計(jì)選定的CpG島來探測(cè)池 （圖1c）。

從104例韓國CRC患者的組織中獲得了基因組DNA，根據(jù)制造商說明書制備靶向亞硫酸氫鹽測(cè)序文庫（圖1d）。為了識(shí)別一些患者不特異的差異甲基化區(qū)域，在計(jì)算健康組織和腫瘤組織的總體平均值后，選擇差異超過30%的區(qū)域（圖1e）。最終在腫瘤組織中鑒定出40個(gè)差異甲基化的CpG島，包括35個(gè)高甲基化區(qū)域和5個(gè)低甲基化區(qū)域。健康組織中平均甲基化水平為29%，腫瘤組織中為78.7%，在83.3%的CRC患者中觀察到這種差異（表1）。

圖1結(jié)直腸癌隊(duì)列特異性DNA甲基化生物標(biāo)志物選擇的總體流程

表1列出了從90例結(jié)直腸癌患者的靶向亞硫酸氫鹽測(cè)序數(shù)據(jù)中選擇的候選CpG島及其匹配的基因，并提供了有關(guān)CpG島及其鄰近基因的基因組和功能位置信息。

2. 候選基因的選擇，以發(fā)展結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物

根據(jù)啟動(dòng)子、基因內(nèi)和基因間區(qū)域觀察40個(gè)差異甲基化CpG島的位置時(shí)，作者觀察到在腫瘤的35個(gè)高甲基化區(qū)域中，16個(gè)CpG島位于啟動(dòng)子區(qū)域，18個(gè)位于基因內(nèi)區(qū)域，1個(gè)位于基因間區(qū)域。在5個(gè)低甲基化區(qū)域中，1個(gè)在啟動(dòng)子區(qū)域，4個(gè)在基因內(nèi)區(qū)域（圖2a和表1）。此外，在18個(gè)高甲基化的基因內(nèi)區(qū)域中，有7個(gè)基因（PDX1、GRIN2D、PITX1、TFAP2A、EN2、MSX1和NR2E1）在腫瘤中表達(dá)增加了2倍以上（圖2b）。為了確定這7個(gè)基因的上調(diào)水平，作者還在TPM值上檢查了其他候選基因的表達(dá)，然后剔除了NR2E1，因?yàn)樗狈y(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2c）。此外，相關(guān)性檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)PDX1、EN2和MSX1在腫瘤中的表達(dá)水平高于正常組織，且甲基化和表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖2b、c）。通過檢測(cè)基因的表達(dá)與CRC患者生存率之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PDX1、EN2、MSX1的高表達(dá)與患者生存呈負(fù)相關(guān)（圖2d）。因此，后續(xù)決定集中研究這三個(gè)基因。

圖2基于差異基因表達(dá)及其與CRC患者生存結(jié)局相關(guān)性的候選DNA甲基化生物標(biāo)志物基因

3. PDX1、EN2或MSX1過表達(dá)促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲

功能分析實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)，過表達(dá)PDX1、EN2和MSX1增加了癌細(xì)胞增殖（圖3a），顯著促進(jìn)HCT116細(xì)胞的遷移（圖3b），這些結(jié)果表明PDX1, EN2和MSX1的過表達(dá)與CRC細(xì)胞的增殖和遷移直接相關(guān)。因此，作者推測(cè)如果這些基因的基因內(nèi)區(qū)域的甲基化變化與基因表達(dá)的變化相關(guān)，那么檢測(cè)標(biāo)記區(qū)域的甲基化變化將能夠預(yù)測(cè)細(xì)胞狀況。

圖3篩選出的候選DNA甲基化生物標(biāo)志物基因通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移來驅(qū)動(dòng)體外致癌特性

4. 設(shè)計(jì)MSP引物以最佳檢測(cè)甲基化變化

為了設(shè)計(jì)針對(duì)PDX1基因內(nèi)CpG島的MSP引物，作者檢測(cè)了該區(qū)域80個(gè)單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化變化。雖然大多數(shù)CpG位點(diǎn)在腫瘤組織和健康組織之間的甲基化變化有很大差異，但最終根據(jù)候選CpG島中每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平的熱圖和線形圖設(shè)計(jì)了MSP引物（圖4a）。PDX1正向引物有4個(gè)CpG位點(diǎn)，反向引物有3個(gè)CpG位點(diǎn)。這7個(gè)CpG位點(diǎn)的β值在正常組織中約為10%，而在腫瘤組織中平均為70%。擴(kuò)增子大小為126 bp和123 bp, Tm為55-57℃（圖4a）。EN2的正向引物和反向引物都有三個(gè)CpG位點(diǎn)。6個(gè)CpG位點(diǎn)的β值在正常組織中約為10%，而在腫瘤組織中平均為70%。擴(kuò)增子大小分別為127 bp和112 bp, Tm為57-58℃（圖4b）。MSX1正向引物和反向引物均有3個(gè)CpG位點(diǎn)。6個(gè)CpG位點(diǎn)的β值在正常組織中約為10%，而在腫瘤組織中平均為70%。擴(kuò)增子大小分別為151 bp和144 bp, Tm為55-57℃（圖4c）。

圖4甲基化特異性PCR （MSP）中引物結(jié)合位點(diǎn)選擇和引物設(shè)計(jì)的優(yōu)化基準(zhǔn)

5. MSP引物可有效檢測(cè)感興趣區(qū)域的甲基化狀態(tài)

在每個(gè)CpG島，甲基化引物在SW480、LoVo和HCT116細(xì)胞中均產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，而在CCD-18Co細(xì)胞中未產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。相反，在CCD-18Co細(xì)胞中檢測(cè)到未甲基化的引物，而在SW480、LoVo和HCT116細(xì)胞中未檢測(cè)到。半甲基化引物未能在CCD-18Co、SW480、LoVo和HCT116細(xì)胞中顯示出明顯的差異（圖4d-f）。當(dāng)我們作者甲基化引物時(shí)，SW480、LoVo和HCT116細(xì)胞的甲基化水平顯著高于CCD-18Co細(xì)胞，而使用半甲基化引物時(shí)則沒有（圖4d-f）。此外，通過qMSP觀察了CCD-18Co和SW480細(xì)胞的差異甲基化水平，發(fā)現(xiàn)對(duì)于PDX1，即使是0.5 ng的模板DNA也足以觀察到這種差異（圖4g-i）。從這些結(jié)果證實(shí)了MSP引物可以非常有效地區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。

6. 建立的MSP引物可以檢測(cè)甲基化狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化

為了檢測(cè)MSP引物是否可以區(qū)分甲基化水平的動(dòng)態(tài)變化，作者使用CRISPR/dCas9-TET1系統(tǒng)（dCas9-TET系統(tǒng)）以位置特異性的方式降低甲基化水平（圖5a）。在將dCas9-TET系統(tǒng)引入PDX1基因組區(qū)域后，使用包含7個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化引物檢測(cè)到甲基化水平顯著降低。然而，半甲基化引物無法檢測(cè)到這一差異（圖5b）。隨著基因內(nèi)區(qū)域甲基化水平的降低，PDX1的表達(dá)顯著降低，表明甲基化的變化與基因表達(dá)的變化直接相關(guān)（圖5c），且EN2和MSX1得到了相似的結(jié)果。使用甲基化引物，能成功檢測(cè)到EN2和MSX1基因內(nèi)區(qū)域的甲基化水平降低，這與基因表達(dá)的降低一致（圖5d-g）。因此，甲基化引物可以檢測(cè)到在基因表達(dá)變化之前發(fā)生的甲基化變化。

圖5定制的MSP引物檢測(cè)由CRISPR/dCas9-gRNA系統(tǒng)調(diào)控的SW480候選生物標(biāo)志物的甲基化變化

7. PDX1、EN2和MSX1的甲基化水平預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

接下來，作者研究了PDX1、EN2和MSX1的基因內(nèi)CpG區(qū)域的甲基化水平是否具有臨床意義。作者利用曼哈頓距離進(jìn)行層次聚類，根據(jù)這些區(qū)域的甲基化水平對(duì)患者進(jìn)行分類，得到兩個(gè)組：高甲基化組（組1,N = 26），中間甲基化和低甲基化組（組2,N = 61）（圖6a）。這兩組在OS（圖6b）和PFS率（圖6c）方面存在顯著差異。此外，周圍淋巴、血管和神經(jīng)侵犯是腫瘤轉(zhuǎn)移后的特征性事件，這些事件在組1中發(fā)生率高于組2。然而，未觀察到細(xì)胞分化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和腫瘤位置的差異，因?yàn)榇蠖鄶?shù)IV期（轉(zhuǎn)移后）患者被納入組1，而大多數(shù)III期（轉(zhuǎn)移前）患者被納入組2（表2）。這些結(jié)果表明，PDX1, EN2和MSX1甲基化水平可以預(yù)測(cè)CRC患者的預(yù)后。

最后，研究MSP系統(tǒng)是否可以區(qū)分這兩個(gè)患者組。與組2中的5例患者相比，組1中的2例患者在PDX1、EN2和MSX1的基因內(nèi)區(qū)域顯示出更高的甲基化水平（圖6d）。該結(jié)果表明，MSP檢測(cè)系統(tǒng)可用于臨床預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后和術(shù)后轉(zhuǎn)移。

圖6通過對(duì)CRC患者的分類顯示了3個(gè)基因甲基化標(biāo)簽的預(yù)后潛力

表2 根據(jù)PDX1、EN2和MSX1基因內(nèi)CpG島甲基化水平分組，收集臨床資料

結(jié)論：

在這項(xiàng)研究中，作者提出了一種識(shí)別CRC預(yù)后標(biāo)志物的實(shí)用方法。作者利用公共數(shù)據(jù)庫并生成合適的高深度靶向亞硫酸氫鹽測(cè)序數(shù)據(jù)來定義韓國東南部特異性差異甲基化區(qū)域（DMRs）。此外，在體外驗(yàn)證了PDX1, EN2和MSX1基因內(nèi)CG基因的增殖能力，并提出了優(yōu)化的qMSP方法，以進(jìn)一步應(yīng)用于臨床領(lǐng)域。基于隊(duì)列患者的隨訪數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)靶向CGI高甲基化的CRC患者的OS顯著降低，復(fù)發(fā)率較高。除了手術(shù)活檢、輔助化療和其他適當(dāng)治療外，定期追蹤預(yù)后因素可能對(duì)晚期CRC患者有幫助。