帕金森病(PD)的一個重要病理生理成分是晝夜節律紊亂，與循環褪黑激素(MLT)水平下降密切相關。近年來有報道稱維甲酸相關孤核受體(RORα)是MLT潛在的內源性配體，在多種疾病中發揮著重要作用。然而，RORα在神經退行性疾病發病機制中的作用尚不清楚。在這里，我們通過一個細胞PD模型顯示，在MPP+處理的BV2細胞中，RORα表達下調，而MLT處理后上調。在MPTP誘導的小鼠模型中，中腦組織中RORα水平降低，MLT處理顯著提高了RORα水平，保護了多巴胺神經元。此外，siRNA介導的下調暗示了STAT通路的參與。總之，MLT通過抑制STAT相關的小膠質細胞的促炎極化來改善神經炎癥，為PD的神經保護治療提供了替代方案。本文于2022年7月發表于“NPJ Parkinson’s Disease”（IF=9.304）上。

技術路線

結果

1）RORα在MPP+處理的BV2細胞中表達下調

為探討RORα是否參與PD的炎癥過程，我們首先研究了不同濃度(0-100 μM)的MPP+對BV2細胞的生物學作用。結果顯示50 μM MPP+誘導的BV2細胞活力下降25-30%(補充圖，未展示)。RT-qPCR和WB分析顯示，MPP+-處理的BV2細胞中，低劑量(10和20 μM) MPP+處理后，RORα的表達增加，但在高劑量(50 μM)時顯著降低(圖1a-c)。我們還觀察到，隨著MPP+濃度的增加，促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)逐漸增加，而IL-10等抗炎因子逐漸減少(圖1d)。RORα表達的改變與細胞因子水平的改變提示RORα在PD中具有抗炎癥作用。

2） MLT在體外增加RORα表達，抑制促炎性M1樣小膠質細胞極化，減少神經炎癥

我們探索了MLT對MPP+處理的BV2細胞的潛在抗炎機制。RT-qPCR和WB分析表明，MLT（50μM）完全逆轉了MPP+在50μM時誘導的RORα的降低，盡管最終水平低于單獨使用MLT（圖2a-c）。同時，ELISA檢測到MLT處理后抗炎細胞因子IL-4和IL-10水平升高，促炎細胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）濃度顯著降低（圖2d），進一步證實了MLT在MPP+處理的BV2細胞中的抗炎作用。此外，在PD的進展過程中，小膠質細胞極化在神經炎癥發病機制中起著重要作用。因此，我們進一步分析了MLT對細胞模型中小膠質細胞分化的影響。在應用MPP+前半小時應用MLT，并在藥物干預后24小時通過RT-qPCR測量極化標志物。結果表明，MLT治療降低了促炎分子（如iNOS、CD36、IL-1β、TNF-α）以及DAM表型因子如TREM2和TLR4的基因表達，但增加了抗炎M2樣標記物CD206和ARG-1的表達（圖2e-g）。這些結果表明，RORα通過減少小膠質細胞中促炎性M1和DAM表型標記物的表達，在MLT的抗炎作用中發揮作用。

3）MPTP處理的小鼠中RORα表達降低，且MLT顯示出減輕MPTP的抗炎作用

為了研究RORα與體內PD之間的關系，我們使用MPTP誘導的PD小鼠模型。與體外結果一致，MPTP處理的小鼠的中腦組織RORα水平下調（圖3a-c）。為了探討MLT在體內是否具有相同的抗炎作用，在MPTP注射前半小時注射MLT。我們觀察到，與對照組相比，MLT治療組的小鼠在運動功能方面表現更好（未展示）。MLT治療后，炎癥因子（包括IL-6、IL-1β、TNF-α）的血清水平降低，而抗炎因子（如IL-4和IL-10）顯著增加（圖3d）。此外，免疫熒光顯示MLT處理可防止TH陽性細胞在SNc中丟失（圖3e，f）。這些結果表明，MLT對DA神經元具有抗炎和保護作用，從而改善MPTP誘導的小鼠模型的運動癥狀。

4）MLT增加MPTP處理小鼠的RORα水平，并降低促炎和DAM相關基因表達

我們觀察到，MLT治療顯著增加了中腦組織的RORα水平（圖4a-c）。RORα的免疫組織化學染色圖像顯示了類似的結果（圖4d，e），表明MLT的作用可能與RORα有關。此外，我們研究了MLT是否能改變MPTP誘導的小鼠的小膠質細胞表型。MPTP和MLT+MPTP處理組的小膠質細胞均因IBA-1的增加而激活。RT-qPCR檢測發現，促炎M1樣和DAM表型標記物減少，而抗炎M2樣表型分子增加(圖3g-i)。類似地，MLT處理組中IBA1+iNOS+細胞的熒光強度小于MPTP組，而MLT+MPTP組中IBA1+ARG-1+細胞的熒光強度高于MPTP組（圖4f，g）。總之，MLT處理通過下調促炎和DAM相關分子改變了小膠質細胞表型。

5）RORα缺失促進小膠質細胞促炎表型極化，加重神經炎癥

據報道，RORα可在多種疾病中發揮抗炎作用。為了驗證RORα在MLT對MPP+處理的BV2細胞的影響中是否發揮了類似的作用，我們進一步確定了RORα缺失對小膠質細胞極化和炎癥的分子效應。SiRNA用于敲除RORα。此外，在MPP+干預前，我們還使用了SR3335，一種合成的RORα選擇性逆激動劑，和SR1078，一種合成的RORα激動劑。在蛋白質水平上，與MPP+處理組相比，MLT和SR1078處理組均顯示出抗炎作用。然而，SR3335并未增加MPP+處理細胞中TNF-α的水平或降低IL-10的水平。更重要的是，與MLT+MPP+的非沉默組相比，RORα敲除增加了培養基中促炎因子（TNF-α和IL-1β）的水平，并降低了抗炎因子（IL-10）（圖5a）。同時，免疫熒光圖像顯示的iNOS的上調和ARG-1的下調也表明，BV2細胞中的RORα缺失可增強促炎極化（圖5b，c）。在mRNA水平上，RT-qPCR顯示出一致的結果，但MLT處理細胞組中ARG1表達除外。MLT+MPP+處理的細胞顯示免疫染色強度增加，但ARG-1的mRNA減少（圖5d）。這些結果表明RORα參與了MLT的抗炎作用。

6）MLT通過STAT的RORα依賴的信號通路調節小膠質細胞極化

據報道，MLT的抗炎作用與STAT通路的激活有關。為了進一步探索與MPP+誘導的神經炎癥和MLT介導的抗炎相關的信號通路，我們檢測了關鍵信號分子STAT的表達和磷酸化，尤其是STAT1和STAT3。結果表明，在MPP+刺激的BV2s中，p-STAT1的表達增加，而p-STAT3的表達顯著降低。MLT預處理抑制p-STAT1的表達，但激活STAT3磷酸化。為了驗證RORα是否參與MLT對STAT通路的影響，使用siRNA來敲除RORα。與沒有RORα-siRNA的細胞組相比，RORα的缺乏顯著降低了p-STAT3的水平，但增加了MLT預處理引起的STAT1的磷酸化（圖6a，b）。這些結果表明MLT通過RORα-STATs途徑介導小膠質細胞的表型變化。

結論：本研究證明MLT通過改變小膠質細胞的表型標志物減輕神經炎癥。MLT調節小膠質細胞向抗炎表型轉變，且RORα在小膠質細胞極化的調節中發揮關鍵作用。該發現指出了MLT-RORα軸的有益作用，其可減少炎癥反應并改善PD。

參考文獻：

Li J, Liu H, Wang X, Xia Y, Huang J, Wang T, Lin Z, Xiong N. Melatonin ameliorates Parkinson's disease via regulating microglia polarization in a RORα-dependent pathway. NPJ Parkinsons Dis. 2022 Jul 8;8(1):90. doi: 10.1038/s41531-022-00352-5.