以往的研究表明，circRNAs在不同的組織和生物中具有高度特異性的表達，但circRNAs的細胞水平結構尚未完全確定。本文表征了circRNAs在人類和小鼠組織單細胞水平的表達圖譜，將我們對circRNAs表達的了解擴展到單細胞水平，并構建了circRNAs的單細胞數據集的在線網站，為以這種前所未有的分辨率探索circRNAs提供了有用的資源。本文于2022年6月發表在《Nature Communications》IF：17.694期刊上。

技術路線

主要研究結果：

1、大規模單細胞研究顯示circRNA具有高度細胞特異性

為了闡明circRNA的細胞構架，作者收集了171項涉及58種不同人類和小鼠組織或細胞類型的公開全長scRNA-seq數據集（圖1a）。考慮到大多數3’RNA測序方法無法檢測到缺乏poly(A)尾的circRNA，所以作者只收集全長測序技術的研究，然后使用嵌入多個最先進工具的綜合管道計算基因和 circRNA 的單細胞水平表達值（圖1b）。總之，40,604個人類和131,533個小鼠單細胞通過質量控制，并檢測這些細胞中的circRNA進行下游分析。為了評估circRNA檢測的可靠性，將所有的單細胞數據中的circRNA比對至circAtlas v2.0或其它數據庫中。如圖1c所示，在scRNA-seq隊列中共檢測到354,390個circRNA，其中76,824（21.67%）個circRNA可以在所有三個circRNA組中同時檢測到。總之，32.43%的circRNA存在于這些批量RNA-seq數據庫中，而其余67.57%的circRNA只在單細胞數據中檢測到。值得注意的是，在circAtlas中唯一檢測到的circRNAs比在circAtlas和單細胞數據集中共享的表達水平更低且長度更短（圖1d，e）。這表明scRNA-seq可以有效捕獲大多數高豐度circRNA。此外，通過MCS評分，這些共享的circRNA顯示出很高的組織特異性，48.9%的共享的circRNA在兩個以上物種中保守（MCS評分≥2），表明鑒定的circRNA具有很高的可靠性（圖1f）。

對于所有在scRNA-seq數據集中檢測到的circRNAs，其表達細胞數量與其平均表達水平之間正相關，一些高表circRNA如mmu-Cdr1_0001、mmu-Tulp4_0006和hsa-RIMS1_0021也在之前的研究中被報道（圖1g）。再次證實了數據分析的可靠性。同時，在 scRNA-seq 數據中唯一檢測到的 circRNA 通常在較少數量的細胞中表達（圖 1h），但與其他數據庫驗證的 circRNA 相比具有相似的表達水平（圖1i），提示這些circRNA具有高度的細胞特異性。特別是在人類和小鼠樣本中，約 90% 的 scRNA-seq 特異性 circRNA 在不到 10 個細胞中表達，這使得使用bulk RNA-seq 技術幾乎無法檢測到（圖1j）。綜上所述，這些結果表明全長 scRNA-seq在揭示具有高細胞特異性的 circRNA 方面具有高靈敏度和可靠性，而由于在傳統bulk RNA-seq 樣本中表達細胞的比例相對較低，其中大部分可能被錯誤地忽略。此外，這些 scRNA-seq 特異性 circRNA 還在具有超過 10 個反向剪接讀數的細胞中廣泛表達（圖1k）。

圖1從單細胞測序數據集這發現circRNAs

2、腦circRNA在抑制性和興奮性神經元中顯示細胞特異性表達模式

為了研究 circRNA 的細胞景觀，首先收集并分析了 18 項對小鼠大腦樣本的研究，這也是收集的數據集中最大的隊列，并分析和整合人類的腦細胞。共將41,911個細胞分為14個簇，檢測到64,311個circRNA（圖2a）。如圖2b所示，大多數細胞聚集成GABA能神經元（GABA）、谷氨酸能神經元（GLUT）和小膠質細胞（MG）。 盡管這些簇中的細胞數量相似，但 GABA 能神經元和谷氨酸能神經元中circRNA尤其地豐富。作者對12個細胞特異性circRNA進行了PCR驗證，并采用廣泛使用的Tau方法檢測了circRNA的細胞特異性，并將基因分為circRNA宿主基因和其他基因進行進一步的比較，如圖2c所示，circRNA的特異性明顯高于兩組基因。同時，circRNA宿主基因的特異性也顯著低于其他非宿主基因，因為circRNA往往來源于具有較高表達水平的基因，這導致細胞特異性相對較低。例如，在神經元細胞中特異性檢測到來自小鼠 Taf1 基因的 12 個 circRNA 中的 10 個，并且在 GABA 能和谷氨酸能神經元中也觀察到了不同的表達模式（圖 2d）。

為了進一步驗證circRNA在人腦中的表達譜，收集4個人腦scRNA-seq數據集，如圖 2e 所示，具有較高表達水平的 circRNA 在兩個物種中更可能是保守的，而物種特異性 circRNA往往具有較低的表達水平。與之前的結果一致，這些保守的circRNA中的大多數在 GABA 能和谷氨酸能神經元中高度富集，并且一部分circRNA也表現出在所有類型的細胞中普遍表達（圖 2f）。circRNA的表達水平與RNA結合蛋白（RBP）的活性密切相關，作者計算了所有circRNA與所有細胞中circRNA宿主基因或RBP之間的Spearman相關系數并進行比較，結果發現circRNA與RBP之間的相關性顯著高于宿主基因（圖2g），尤其是PTBP1和PTBP2和circRNA高度相關。如預期的，在大多數細胞類型中，circRNA的表達水平，如circCdr1和circular-to-linear比率與PTBP1的下調及其補償因子PTBP2的上調高度相關（圖2h）。總之，這些結果證明了circRNA的高度細胞特異性表達景觀，并進一步揭示了circRNA生物發生與RBP活性之間的復雜關聯，特別是在這些抑制性和興奮性神經元中。

圖2 抑制性和興奮性神經元中具有豐富的circRNA

3、早期胚胎發育過程中母體和合子circRNA的動態表達

單細胞RNA測序使胚胎發育階段的基因異質性研究成為可能，但這一過程中circRNA表達模式的變化仍需進一步探索。作者分析了11項人類和小鼠胚胎研究，其中包含來自16個從卵母細胞到早期芽的不同階段的樣本（圖 3a）。在人和小鼠胚胎中分別檢測到41,041和24,818個circRNA。為了揭示胚胎發育過程中circRNA之間的動態變化，計算了不同階段circRNA表達水平之間的Pearson相關性。如圖3b所示，在受精后的前3-4天觀察到細胞之間的高度相關性，這與circRNA在早期胚胎發育過程中的母體效應一致。此外，從囊胚到植入胚胎的細胞表現出不同的 circRNA 表達模式，表明合子 circRNA 在囊胚期后表達。此外，在人類和小鼠樣本上均觀察到在發育階段檢測到的circRNA的多樣性和連接率都有所增加，這也驗證了這些合子circRNAs在胚胎發育過程中的積累（圖3c）。考慮到在人類數據集中只收集到相對較少的細胞，下游分析只包括小鼠胚胎。為了消除隨機性效應，可以在兩個以上階段檢測到circRNA的表達模式繪制在圖3d中。如預期的，觀察到母體 circRNAs 逐漸降解，大多數其他 circRNAs 表現出階段特異性表達譜。為進一步研究母體向合子轉變過程中circRNA的動態表達變化，將樣本分為四個時間點，包括全能卵裂球（TB）、第一譜系（TE/ICM）、第二譜系（EPI/PE）和植入胚胎，反映發育過程中全能性和譜系分離的變化。隨后，將基因和circRNA聚類為5組。如圖3e所示，簇1和簇2中的circRNA和基因在TB早期高表達，然后隨著胚胎發育不斷下降。相反，第3到第5簇 circRNA代表受精后特異性表達的合子circRNA。

為確定合子circRNA的激活是否是宿主基因表達的副產物，檢查了circRNA與其宿主基因之間的對應關系。大部分合子circRNA（簇3中67.50%、簇4中69.2%和簇5中83.9%）是由母體表達的基因產生的，這表明這些合子circRNA在胚胎發育過程中具有獨特的生物發生機制（圖3h）。為進一步研究合子基因和circRNA激活過程之間的差異，計算每個簇中基因和circRNA的reads組成。僅包括在一個以上階段中同時表達的circRNA。與發育階段合子基因讀數的溫和增加相反，在圖3g中觀察到8個細胞階段后合子 circRNA的急劇爆發，為母體circRNA降解和合子circRNA激活提供了令人信服的證據。例如，作者展示了兩個合子和三個母體 circRNA 的不同表達模式。如圖3h所示，源自Erdr1的mmu-Erdr1_0001和mmu-Erdr1_0002是一種調節細胞存活和細胞凋亡的分泌因子，在植入的胚胎中高度表達。因此，這些circRNA的高度特異性表達表明，與線性基因相比，circRNA 經歷了更顯著的母體到合子的轉變過程。最后，對母本和合子circRNA的親本基因進行基因本體富集分析。如圖3i所示，基于微管的運動和纖毛組裝在母體circRNA中富集，而剪接相關過程在合子circRNA中富集，這與發育中胚胎的極性建立和胚胎基因組激活一致。總的來說，這些結果證明了circRNA 的高度細胞特異性表達譜和合子circRNA在胚胎發育中的大量激活，這也表明了這些母體和合子circRNA 在此過程中的重要作用。

圖3 母體向合子轉變過程中合子circRNA 激活的解析

4、在人類乳腺癌轉移中的腫瘤間和腫瘤內circRNA異質性

為分析乳腺癌腫瘤發生過程中的單細胞水平的circRNA，對26個原發性和轉移性腫瘤 scRNA-seq 樣本進行分析，如圖4a所示。然后，進一步研究正常人群和癌人群circRNA表達水平的差異。如圖4b所示，超過49.88%的正常人群和67.28%的癌人群被鑒定為上皮細胞。與之前的研究一致，非整倍體重排的腫瘤細胞在轉移瘤和原發瘤中circRNAs的表達均顯著降低（圖4c），在大多數已鑒定的細胞類型中也觀察到同樣的情況（圖4d）。來自預后較好的低級別（luminal A、luminal B和HER2陰性）腫瘤的正常細胞和癌細胞往往比高級別三陰性乳腺癌（TNBC）細胞表達更多的circRNA，這表明積累較少TNBC細胞中的circRNAs 具有更快的進展速度。

鑒于該隊列中上皮細胞的主要數量以及EMT在腫瘤侵襲和轉移中的重要作用，所以作者進一步研究了EMT期間的circRNA。首先，將所有上皮細胞聚集在一起，并進行軌跡推斷分析以揭示動態細胞的分化過程（圖4f）。為了更好地探索單個細胞的過渡狀態，計算了EMT分數。如圖4g所示，細胞軌跡結果通常相應地擬合EMT分數的增加。GO富集分析上皮細胞增殖過程在EMT評分較低的簇中富集，而細胞遷移和間充質相關過程在EMT水平較高的簇中富集。此外，計算每個簇中癌細胞的比例，并相應地觀察到腫瘤細胞百分比與EMT評分之間的正相關（圖4h）。最后計算每個簇中circRNA的表達水平，隨著從上皮細胞（簇 1-2）到中間EMT狀態（簇 3-5）的轉變，circRNA 的平均表達水平相應增加（圖 4i），這與EMT期間circRNA的全局激活一致。總之，作者分析了EMT期間circRNA表達的詳細概況，揭示了乳腺癌患者原發性和轉移性樣本之間circRNA 的復雜腫瘤間和腫瘤內異質性。

圖4 乳腺癌患者正常細胞和腫瘤細胞之間circRNA的異質性

5、細胞特異性circRNA為最佳細胞類型的識別提供了的見解

基于circRNAs的高度細胞特異性，作者推測了利用circRNAs作為生物標志物來提高細胞類型的可能性。為了構建高質量的circRNA特征矩陣，研究了來自17個不同人類和小鼠組織的scRNA-seq隊列以及同源的癌癥樣本（圖5a）。在不同細胞類型和組織類型中所有的circRNA根據其表達模式被分為5類（圖5b）。隨后，作者總結了人和小鼠樣本中circRNAs的細胞類型特異性，共享的circRNAs的關系如圖5c所示。與之前研究中報道的基因表達圖譜相似，circRNAs 在不同功能的細胞類型之間也表現出不同的表達簇。此外，還檢測到人和小鼠細胞之間的幾種直系同源細胞類型特異性circRNA，這意味著這些circRNA亞群具有保守的生物學功能。

為了驗證circRNA作為細胞類型生物標志物的潛力，計算了在不同細胞類型中表達的circRNA與bulk RNA-seq數據集之間的重疊。如圖5d所示，在bulk RNA-seq 數據中檢測到的circRNA與細胞表達的circRNA具有高度特異性的重疊。例如，在GABAergic神經元中檢測到的39.36%的circRNA也可以在正常腦樣本中同時檢測到。為了比較circRNA和基因作為細胞生物標志物在分析腫瘤浸潤細胞中的潛能，只有在人類腫瘤樣本中注釋到的細胞類型被用于下游分析。之后，計算了所有表達的circRNA、來自公共數據庫的標志基因和1000個隨機選擇基因的細胞類型特異性。值得注意的是，circRNAs的細胞類型特異性顯著高于標記基因和隨機對照基因，這進一步表明circRNAs作為細胞類型生物標志物的能力（圖5e）。然后，使用CIBERSORT68計算癌癥相關的bulk RNA-seq數據集中腫瘤浸潤免疫細胞的組成，分別基于LM22基因組的標記基因和細胞類型特異性circRNA的表達（圖5f）。基于circRNA和基因的反卷積結果都被整合到 scRNA-seq 隊列中鑒定的10種免疫細胞類型中。隨后利用對數尺度均方根誤差（RMSE）評估CIBERSORT 提供的細胞特異性反卷積的結果，它代表原始標記基因表達值和推算標記基因表達值之間的偏差。如圖5g所示，使用circRNA的反卷積結果具有顯著更低的RMSE值，這表明circRNA估計細胞組成的效果更準確。這些結果證明了circRNA在探索腫瘤浸潤性免疫細胞異質性方面作為更好的細胞類型生物標志物的適用性，也表明了這些circRNA在某些細胞類型中的重要生物學作用。

圖5 探索細胞類型特異性circRNA作為細胞成分去褶積的生物標志物

作者將circRNA的細胞結構和免疫細胞中的circRNA特征矩陣集成到稱為 circRNA單細胞門戶（circSC）的網絡服務器中。circSC提供全面的circRNA信息，包括細胞表達譜、差異表達結果以及在大量人類和小鼠細胞中鑒定的 circRNA 目錄（圖 6）。circSC已作為單獨的模塊集成到circAtlas中（http://circatlas.biols.ac.cn/），為circRNA的單細胞和bulk RNA-seq表達模式提供方便的瀏覽和搜索功能。作者認為該數據庫可以作為探索circRNA在胚胎發育、組織分化和癌癥生物發生過程中動態變化的重要資源，并為circRNA群落提供一個獨特而有用的平臺。

圖6 circSC在線網站的建設與功能

參考文獻：

Wu Wanying., Zhang Jinyang., Cao Xiaofei., Cai Zhengyi., Zhao Fangqing.(2022). Exploring the cellular landscape of circular RNAs using full-length single-cell RNA sequencing. Nat Commun, 13(1), 3242. doi:10.1038/s41467-022-30963-8