2020 年全球新診斷腎癌病例超過431280例，其中最常見的組織學(xué)亞型是透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌 (ccRCC)，約占所有腎細(xì)胞癌 (RCC) 病例的 70-80%。RCC 的一個(gè)獨(dú)特臨床方面是它可以通過腎靜脈侵入下腔靜脈 (IVC)，甚至長到右心腔。大約 15% 的RCC患者報(bào)告了腎靜脈或下腔靜脈中的靜脈腫瘤血栓 (TT)。腫瘤血栓水平不一定影響疾病特異性生存，但對手術(shù)的復(fù)雜性有重大影響，具有顯著的出血風(fēng)險(xiǎn)、不穩(wěn)定的血流動(dòng)力學(xué)和死亡。新輔助全身治療可能潛在地降低 TT 負(fù)擔(dān)，從而提高腫瘤血栓切除術(shù)的安全性和可行性，從而潛在地提高手術(shù)切除的治愈潛力。然而，對 TT 形成的潛在機(jī)制知之甚少，這阻礙了設(shè)計(jì)有效的新輔助療法來降低腫瘤血栓的分期和降低血栓切除術(shù)的圍手術(shù)期發(fā)病率和死亡率。

今天我們介紹一篇關(guān)于腎癌靜脈腫瘤血栓單細(xì)胞測序的文章，該文章發(fā)表于Genome biology期刊，IF=17.9。改文章利用單細(xì)胞RNA測序解碼透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中腔靜脈瘤栓的多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)，探索腔靜脈瘤栓的形成機(jī)制。

腫瘤血栓和匹配的原發(fā)性腫瘤中腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的 scRNA-seq 分析

為了闡明靜脈腫瘤血栓中的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，我們從未接受治療的 ccRCC 患者（ccRCC，n ?= 8）收集了19個(gè)手術(shù)組織標(biāo)本用于scRNA-seq。腫瘤血栓（n ?= 8）、成對的原發(fā)性腫瘤（n ?= 8）和鄰近腎組織（n ?= 3）分別稱為 TT、PT 和 ART。此外，還納入了4個(gè)不同的RNA-seq 數(shù)據(jù)以進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。從140805個(gè)細(xì)胞中獲得了大約10億個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本：62035個(gè)細(xì)胞來自TT，58695 個(gè)細(xì)胞來自 PT，20075個(gè)細(xì)胞來自ART。根據(jù)典型基因標(biāo)記的表達(dá)，識(shí)別并可視化了 9 種主要細(xì)胞類型：上皮細(xì)胞、T 細(xì)胞、自然殺傷 (NK) 細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞 (EC)、B 細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞。我們的結(jié)果揭示了 ART、PT 和 TT 樣本之間生態(tài)系統(tǒng)組成的顯著異質(zhì)性。

與原發(fā)性腫瘤相比，T/NK 細(xì)胞聚集和狀態(tài)分析確定腫瘤血栓富含組織駐留 CD8+T細(xì)胞，處于祖細(xì)胞耗盡狀態(tài)

考慮到研究觀察到免疫檢查點(diǎn)（ICB）治療后 ccRCC 患者的腫瘤血栓顯著減少，我們推測腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞可能在該過程中發(fā)揮重要作用。因此，我們首先對 T 和 NK 細(xì)胞進(jìn)行了無監(jiān)督聚類，并在 ART、PT 和 TT 中獲得了12個(gè)簇，包括 CD4+ T 細(xì)胞的四個(gè)亞型，CD8 + T 細(xì)胞的五個(gè)亞型，兩個(gè)NK亞簇和一個(gè) NKT 簇。

為了確定 ARTs、PTs 和 TTs 之間的差異，我們計(jì)算了 ARTs、PTs 和 TTs 中每個(gè)簇的百分比，發(fā)現(xiàn) PTs 中幼稚 CD4 + T 細(xì)胞 (CD4-C1) 的相對百分比低于ARTs 和 TTs，抑制性 Tregs（CD4-C4）的比例更高，表明 PT 中可能存在更多的免疫抑制狀態(tài)。

雖然在正常腎臟組織中發(fā)現(xiàn)了大量的組織駐留 CD8 + T 細(xì)胞，但其機(jī)制仍然很大程度上未知。與我們的發(fā)現(xiàn)一致，另一項(xiàng)關(guān)于肝細(xì)胞癌 (HCC) 的研究也揭示了組織駐留的CD8 + T 細(xì)胞在鄰近的非腫瘤組織中比在腫瘤中更豐富。此外，正如之前在 ccRCC [ 36 ] 中觀察到的，耗盡的 CD8 + T 細(xì)胞（CD8-C3）在腫瘤組織中的比例增加，但 PT 和 TT 之間沒有顯著差異，表明 CD8 + T 細(xì)胞在 PT 和 TT 中均已耗盡。在時(shí)間分析中，我們移除了 MAIT 細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌?TCR 特征。CD8-C1 到 C4 的連續(xù)發(fā)展軌跡代表了一個(gè)二元分支結(jié)構(gòu)：CD8-C1 是根，CD8-C3 和 C4 是兩個(gè)分支的結(jié)束狀態(tài)，CD8-C2 處于過渡狀態(tài)，在PTs和TTs之間非常相似。從軌跡的通路分析表明，T細(xì)胞活化和淋巴細(xì)胞分化較早，細(xì)胞周期、ATP代謝和缺氧相關(guān)通路在CD8 +的終末狀態(tài)高度富集。這些結(jié)果表明，CD8 + T 細(xì)胞在 PTs 和 TTs 之間具有相同的過渡軌跡，伴隨著功能失調(diào)和代謝紊亂，最終在 PTs 和 TTs 中都被耗盡。

有證據(jù)表明，某些處于祖細(xì)胞衰竭狀態(tài)的CD8 + T細(xì)胞可以增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）治療黑色素瘤和腎癌的療效。同時(shí)，考慮到一些 ccRCC 患者使用 ICB 治療后 TT 的顯著消退，我們詢問是否有某些我們恢復(fù)的 CD8 + T 細(xì)胞亞群可能類似于祖細(xì)胞耗盡表型。然后，我們根據(jù)已發(fā)表的研究對 CD8 + T 細(xì)胞亞群的祖細(xì)胞和最終耗盡的基因特征進(jìn)行評分]。我們注意到，CD8-C1 亞簇中的祖細(xì)胞耗盡簽名顯著富集，并且最終耗盡簽名明顯低于其他子集。此外，大多數(shù)祖細(xì)胞耗盡的特征基因在 TT 樣本中的 CD8-C1 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，這進(jìn)一步證明了祖細(xì)胞耗盡的表型富含TT。此外，我們檢查了一大群具有配對 PT 和 TT大轉(zhuǎn)錄組的患者，觀察到與 PTs 相比，TTs 中 CD8-C1 亞群的比例顯著增加，并且在 TTs 中，祖細(xì)胞耗盡和 CD8-C1 特征評分均上調(diào)。確定了 CD8-C1 細(xì)胞（組織駐留的 CD8 + T 細(xì)胞）及其特征在 TT 中比在 PT 中更豐富，我們接下來檢查了我們發(fā)現(xiàn)的 CD8-C1 細(xì)胞是否會(huì)對抗 PD-1 治療表現(xiàn)出更好的反應(yīng)使用來自接受 nivolumab（抗 PD-1）治療的更大規(guī)模 ccRCC 患者（CheckMate 025）的治療前大量 RNA-seq 數(shù)據(jù)。總的來說，這些結(jié)果表明，原發(fā)性 ccRCC 和腫瘤血栓中組織駐留 CD8 + T 細(xì)胞的高特征可能是對 ICB 治療反應(yīng)良好的暗示。

巨噬細(xì)胞在腫瘤血栓中表現(xiàn)出增強(qiáng)的 ECM 重塑活性，在原發(fā)性腫瘤中表現(xiàn)出免疫反應(yīng)性擾動(dòng)

除了適應(yīng)性免疫外，先天免疫細(xì)胞可能是血管內(nèi) TT 快速擴(kuò)展的第一道屏障，這可能對腫瘤血栓形成和對 ICB 治療的抵抗有重要影響。因此，我們分析了 PT、TT和 ART中 16267 個(gè)骨髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。骨髓細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，分為 14 個(gè)簇。基于典型標(biāo)記的表達(dá)，我們將這些簇注釋為巨噬細(xì)胞的六種亞型，單核細(xì)胞的兩種亞型（Mono1-Mono2），DCs 的四種（DC1-DC4），中性粒細(xì)胞的一種和循環(huán)細(xì)胞的一種。與 ART 相比，巨噬細(xì)胞在 PT 和 TT 中富集，除了 Macro4 簇。與 ART 相比，PT 和 TT 中的中性粒細(xì)胞顯著減少，暗示 PTs 和 TTs 的腫瘤細(xì)胞可能逃脫循環(huán)中性粒細(xì)胞的清除。為了更好地了解這些骨髓相關(guān)人群的作用，我們首先檢查了免疫檢查點(diǎn)和逃避相關(guān)的基因表達(dá)水平。除中性粒細(xì)胞外，幾乎所有這些基因都在骨髓亞群中高度表達(dá)。雖然CD274 ( PD - L1 ) 和PDCD1LG2 ( PD - L2 ) 都是PD-1信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo) T 細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)的配體，但在所有骨髓亞群中都很少檢測到。這些結(jié)果表明，中性粒細(xì)胞可能更有效地對抗癌細(xì)胞，而其他巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和 DC 可能已經(jīng)被 PT 或 TT 腫瘤細(xì)胞影響。

巨噬細(xì)胞通常分為兩種典型亞型，促炎 M1 和抗炎 M2。然而，我們無法通過已知的標(biāo)記基因如CD86、TLR4 (M1) 和CD163和MSR1 (M2) 清楚地區(qū)分 M1 和 M2 巨噬細(xì)胞。雖然腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM) 標(biāo)志物，以及作為M1/M2 和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM) 標(biāo)志物的CD68和HLA - DRA在每個(gè)巨噬細(xì)胞亞型中都高度表達(dá)，表明它們都是 TAM。有趣的是，我們注意到促炎表型中的基因表達(dá)特征顯著富集，例如對干擾素的反應(yīng)，以及與 TT 相比，PT 的 TAM 中的抗原呈遞途徑。令人驚訝的是，與 TT 相比，PT 中的這些 TAM 還上調(diào)了免疫檢查點(diǎn)和逃避標(biāo)記的表達(dá)。因此，PTs 中的 TAMs 表現(xiàn)出促炎和免疫抑制表型，可能有助于腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。然而，在 TTs 中，我們觀察到與腫瘤進(jìn)展相關(guān)途徑相關(guān)的特征評分增加，包括上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織和血管生成。總的來說，TAM 的復(fù)雜性表明 PT 和 TT 之間存在明顯的功能障礙狀態(tài)，PT 中具有更強(qiáng)的免疫抑制表型，并且 TT 中的 ECM 重塑增強(qiáng)。

惡性細(xì)胞在腫瘤血栓中表現(xiàn)出增加的 ECM 重塑，在原發(fā)性腫瘤中表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫抑制表型

為了更好地了解可能與免疫細(xì)胞一起發(fā)揮作用的癌細(xì)胞中活躍的細(xì)胞程序，我們接下來試圖確定 PT 和 TT 之間惡性細(xì)胞的表達(dá)模式。根據(jù)一項(xiàng)已發(fā)表的研究，通過使用肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞作為參考，通過 scRNA-seq 數(shù)據(jù)推斷的拷貝數(shù)變異 (CNV) 檢測證實(shí)了腫瘤細(xì)胞。除患者 P06 外，8 名患者中有 7 名在 TT 和 PT 之間顯示出相似的 CNV 模式和亞克隆結(jié)構(gòu)，支持先前關(guān)于 TT 中有限的附加基因組改變的研究。然后，我們評估了PT和TT之間惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄差異。我們總共從 PT 中獲得了15012個(gè)惡性上皮細(xì)胞，從TT標(biāo)本中獲得了12078個(gè)細(xì)胞。由于近端小管細(xì)胞已被確定為 ccRCC，然后我們比較了惡性細(xì)胞和近端小管細(xì)胞的缺氧和血管生成特征，這是導(dǎo)致致癌作用的兩種經(jīng)典生物狀態(tài)。與先前的研究一致，PT 和 TT 惡性細(xì)胞的缺氧和血管生成特征明顯高于來自 ART 的細(xì)胞。然后，針對惡性細(xì)胞，我們總共獲得了4個(gè)簇，每個(gè)亞簇中個(gè)體患者的比例不同，進(jìn)一步支持了高度的腫瘤間異質(zhì)性。為了更好地理解它們的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，我們通過 GSVA Hallmark 分析對四個(gè)簇進(jìn)行了評分，并觀察到每個(gè)簇之間的顯著轉(zhuǎn)錄程序差異。具體來說，簇 1 是最豐富的，其特征是缺氧、糖酵解、氧化磷酸化 (OXPHOS) 增加，以及伴隨的免疫激活和代謝途徑。另一項(xiàng)研究報(bào)告了 ccRCC 中糖酵解和 OXPHOS 代謝狀態(tài)的共存，其中 RCC 中的混合表型有助于代謝可塑性，使癌細(xì)胞能夠適應(yīng)各種微環(huán)境。此外，有趣的是，與 TAM 相似，我們觀察到與 TT 相比，PT 中與干擾素-γ (IFN-γ) 反應(yīng)和抗原呈遞途徑相關(guān)的基因富集，免疫檢查點(diǎn)和逃避基因的表達(dá)上調(diào)。它證明了它們促進(jìn)免疫逃逸和抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力。而 TT 腫瘤細(xì)胞在 ECM 重塑和對金屬離子相關(guān)通路的反應(yīng)中被激活。與這些結(jié)果一致，在 PT 中觀察到顯著更高比例的CD274 +惡性細(xì)胞，在 TT 中觀察到更多的 COL4A1 + 腫瘤細(xì)胞，表明 PTs 中較高的免疫抑制狀態(tài)和 TTs 中 ECM 的動(dòng)態(tài)重塑。此外，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的鐵死亡抑制基因GPX4在 TTs 中表達(dá)上調(diào)，這意味著通過調(diào)節(jié)GPX4來誘導(dǎo)鐵死亡可能在 TTs 中比在 ccRCC 患者的 PTs 中更有效。總之，在單細(xì)胞分辨率下，我們發(fā)現(xiàn) PT 中的惡性細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫抑制表型，而 TT 中的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的 ECM 重編程狀態(tài)。

內(nèi)皮細(xì)胞代表腫瘤血栓中 ECM 重塑相關(guān)通路的上調(diào)，高豐度的CCL4 +和NDUFA4L2 +內(nèi)皮細(xì)胞與較差的存活率相關(guān)

為了進(jìn)一步評估可能促進(jìn)腫瘤血栓在血管內(nèi)生長和擴(kuò)展的內(nèi)皮細(xì)胞作用，我們專注于內(nèi)皮細(xì)胞 (EC)，并從 PT、TT和ART。這些細(xì)胞被亞簇成六個(gè)不同的簇，它們中的每一個(gè)都是基于 ECs中的經(jīng)典表達(dá)基因鑒定的，包括腎小球樣 ECs (Endo1: SOST + )、癌癥相關(guān) ECs (Endo2 : NDUFA4L2 + )、動(dòng)脈 ECs (Endo3: GJA5 + )、ACKR1 + ECs (Endo4: ACKR1 + )、尖端細(xì)胞 (Endo6: CXCR4 + )和一個(gè)未定義的簇 (Endo5)。此外，我們發(fā)現(xiàn) TTs 中 Endo2 的比率高于 ARTs 和 PTs，表明與癌癥相關(guān)的脈管系統(tǒng)形成可能有助于 TT 在血管內(nèi)空間中的快速延伸。作為支持，我們通過分析來自具有 30 對 PT 和 TT 的大量患者的大量轉(zhuǎn)錄組，觀察到 TT 中 Endo2 子集的百分比顯著增加。此外，高水平的 Endo2 基因特征與 TCGA KIRC 隊(duì)列中的低生存率顯著相關(guān)。有趣的是，與 TAM 和惡性細(xì)胞一樣，我們發(fā)現(xiàn) PT 的 EC 中與干擾素反應(yīng)和抗原結(jié)合途徑相關(guān)的表達(dá)特征顯著增加，但伴隨著與 PT 和 TT 之間的 EC 子集的免疫抑制相關(guān)的基因表達(dá)的變化。同時(shí)，我們注意到在 Endo2 亞群中，與 TT 相比，PT 中大多數(shù)與免疫抑制相關(guān)的基因的表達(dá)水平上調(diào)，表明 PT 中的這些細(xì)胞可能處于更免疫抑制狀態(tài). 此外，我們發(fā)現(xiàn) ECs 在 TTs 中具有增強(qiáng)的 ECM 重塑和細(xì)胞增殖活性。因此，這些數(shù)據(jù)表明，除了 TAM 和 TT 中的癌細(xì)胞外，TT 中的內(nèi)皮細(xì)胞可能會(huì)修飾 ECM 以促進(jìn)腫瘤血栓的生長，而針對具有 Endo2 特征的細(xì)胞的分子療法可能能夠特異性地降低腔靜脈血栓的階段。

腫瘤-基質(zhì)相互作用重塑了與存活率低相關(guān)的腫瘤血栓中的細(xì)胞外基質(zhì)

鑒于與 PT 相比，活化的 ECM 重塑作為 TT 的巨噬細(xì)胞、惡性細(xì)胞、EC 和肌成纖維細(xì)胞的共同趨勢的觀察結(jié)果，我們假設(shè)不同的細(xì)胞群參與了復(fù)雜的串?dāng)_。為了識(shí)別可能的非細(xì)胞自主效應(yīng)，我們使用 CellPhoneDB 通過已知的受體-配體對識(shí)別不同細(xì)胞群之間的假定信號(hào)傳導(dǎo)。值得注意的是，與 ART 和 PT 相比，ECM 重塑途徑中多個(gè)配體-受體對的相互作用在 TT 中更強(qiáng)，并且預(yù)測肌成纖維細(xì)胞具有與腫瘤細(xì)胞和 EC 顯著相互作用的最強(qiáng)信號(hào)，無論它們的亞組如何。我們還在驗(yàn)證隊(duì)列中使用 30 對PT和TT大量RNA-seq 數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)。與 TT 中基質(zhì)細(xì)胞和其他類型細(xì)胞中 ECM 成分及其受體的上調(diào)表達(dá)一致，與 PT 相比，ECM 組裝特征與 TT 中 CIBERSORTx 估計(jì)的肌成纖維細(xì)胞分?jǐn)?shù)的相關(guān)性更強(qiáng)，支持 ECM 重塑相關(guān)通路在 TT 中比在 PT 中更激活。

鑒于肌成纖維細(xì)胞與惡性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的強(qiáng)相互作用，我們首先檢查了腫瘤細(xì)胞是否控制基質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的募集。我們發(fā)現(xiàn)了肌成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的廣泛相互作用。詳細(xì)地說，與 PT 相比，腫瘤細(xì)胞上調(diào)了 COL20A1、COL28A1和TGFB1的表達(dá)，以在 TT 中募集更多的肌成纖維細(xì)胞。此外，肌成纖維細(xì)胞釋放膠原相關(guān)基因如COL6A2、COL1A2和COL4A2以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)組裝，并且與 TTs 中肌成纖維細(xì)胞的豐度具有更高的相關(guān)性。TTs中肌成纖維細(xì)胞的相對豐度與腫瘤細(xì)胞中上調(diào)的細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)基因之間的相關(guān)性顯著高于PTs。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞可能通過分泌 ECM 相關(guān)成分在 TT 中募集更多的肌成纖維細(xì)胞。此外，我們還發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞在 TTs 中比在 PTs 中增強(qiáng)了 ECs 的募集，這可能促進(jìn)血管生成。此外，在 30 對 PT 和 TT ccRCC 患者的驗(yàn)證隊(duì)列中，TTs 中 ECM 組裝、含膠原的 ECM 和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織的表達(dá)特征評分均高于 PTs。因此，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤血栓中更強(qiáng)的腫瘤-基質(zhì)相互作用伴隨著腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中一組特定的 ECM 相關(guān)基因和通路的上調(diào)表達(dá)。

為了進(jìn)一步研究腫瘤-基質(zhì)相互作用與患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，我們使用顯著的 LR 對定義了兩個(gè)相互作用特征評分，以計(jì)算 TCGA KIRC 隊(duì)列中 ECM 重塑相關(guān)相互作用的強(qiáng)度。計(jì)算腫瘤細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的腫瘤-基質(zhì)相互作用評分，而在肌成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間產(chǎn)生基質(zhì)-腫瘤相互作用評分。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)更強(qiáng)的腫瘤 - 基質(zhì)相互作用與較差的生存率相關(guān)。總之，腫瘤-基質(zhì)相互作用重塑了與存活率低相關(guān)的腫瘤血栓中的細(xì)胞外基質(zhì)。

總之，本研究提供了原發(fā)性腫瘤和腫瘤血栓之間在腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞方面表型異質(zhì)性的證據(jù)。我們的數(shù)據(jù)可以成為寶貴的資源，有助于更深入地了解與腫瘤血栓相關(guān)的機(jī)制，并有助于為晚期 ccRCC TT 患者開發(fā)更有效的新輔助分子療法和生物標(biāo)志物。