lncRNAs與多種癌癥的發生有關。在我們之前的研究中,我們證明HDAC1/4介導的miR-200b沉默增強了人肺腺癌(LAD)細胞對多西紫杉醇(DTX)的耐藥性。在此,我們探討了LncRNA MARCKSL1–2在LAD細胞DTX抗性中的作用。我們發現在DTX抗性的LAD細胞中,MARCKSL1–2表達顯著降低。MARCKSL1–2抑制親代和DTX抗性的LAD細胞的生長和DTX耐藥性。此外,我們發現,MARCKSL1–2通過增加miR-200b表達和抑制HDAC1在LAD中發揮作用。從機制上講,MARCSKL1–2將SUZ12招募到HDAC1的啟動子,以加強HDAC1啟動子的H3K27me3,從而降低HDAC1的表達。MARCKSL1–2通過阻斷HDAC1對miR-200b啟動子組蛋白乙酰化修飾的抑制作用上調miR-200 b。小鼠異種移植腫瘤模型的體內分析表明MARCKSL1–2的過表達減弱LAD腫瘤中的DTX抗性。本文于2022年7月發表于Molecular Cancer(IF=41.444)上。
技術路線
結果
1)MARCKSL1-2的下調與LAD患者的DTX耐藥性和不良預后相關
根據腫瘤對化療的反應,將60例LAD組織分為DTX不敏感組(SD+PD)和敏感組(CR+PR)。有趣的是,RT-qPCR數據表明,與敏感組相比,不敏感LAD組織中的MARCKSL1–2水平顯著下調(圖1a)。此外,腫瘤組織中的MARCKSL1–2水平低于正常肺組織中的水平(圖1b)。Kaplan-Meier分析結果顯示,較低的MARCKSL1–2水平與LAD患者的PFS和OS較短相關(圖1c-d)。基于上述數據,我們評估了MARCKSL1–2與LAD細胞中DTX抗性的相關性。RT-qPCR揭示,與親代細胞相比,耐DTX的LAD細胞中的MARCKSL1-2水平顯著下降(圖1e),表明MARCKSL1-2與人類LAD細胞的耐DTX相關。在探索其功能之前,我們分析了MARCKSL1–2的細胞分布。數據顯示MARCKSL1–2主要存在于細胞核中(圖1f-g)。類似地,FISH圖像表明,MARCKSL1–2的染色主要在細胞核中,抗性細胞中觀察到的MARCKSL1–2信號少于親代細胞(圖1h)。這些結果表明,MARCKSL1–2在DTX抗性的LAD細胞中低水平表達。
2)MARCKSL1-2對DTX處理下耐DTX或敏感LAD細胞行為的影響
為了確定MARCKSL1–2在LAD細胞中的生物學功能,我們沉默了H1299和SPC-A1細胞中的MARCKSL2表達,同時上調了H129P/DTX和SPC-A1/DTX細胞中的MARCKSL1–2表達。當MARCKSL1–2在H1299和SPC-A1細胞中沉默時,增殖能力明顯增強。相反,MARCKSL1–2的過表達阻礙了H1299/DTX和SPC-A1/DTX細胞的增殖(圖2a-d)。此外,流式細胞儀和TUNEL檢測結果顯示,5、10 μg/L DTX作用下,缺失MARCKSL1-2可降低H1299和SPC-A1細胞的凋亡率,而上調MARCKSL1-2可誘導0、50、100 μg/L DTX作用下H1299/DTX和SPC-A1/DTX細胞的凋亡率(圖2e-h)。這些結果表明,MARCKSL1–2在DTX敏感和耐藥LAD細胞中均起到生長抑制作用。
3)MARCKSL1-2通過調節HDAC1和miR-200b減輕LAD細胞的DTX抗性
我們先前的研究表明,HDAC1/4和miR200b參與LAD細胞的DTX抗性。在此,我們研究了MARCKSL1–2是否可以調節HDAC1/4和miR-200以降低DTX抗性。有趣的是,我們發現MARCKSL1–2在親代和DTX抗性LAD細胞中負調節HDAC1,正調節miR-200b(圖3a-d)。由于MARCKSL1–2主要分布在LAD細胞的細胞核中,我們評估了MARCKSL2–2對HDAC1和miR-200b轉錄的影響。來自熒光素酶報告分析的數據顯示,在H1299和SPC-A1細胞中,MARCKSL1-2敲低后miR-200b啟動子熒光素酶強度降低,而在H1299/DTX和SPC-A1/DTX細胞中,MARCKSL1-2上調后miR-200b啟動子熒光素酶強度升高(圖3e)。相反,在所示細胞中,HDAC1啟動子的熒光素酶活性顯示出與miR-200b啟動子相反的趨勢(圖3f)。更重要的是,經驗證,通過HDAC1干擾或miR-200b模擬,可以抵消由MARCKSL1–2敲除誘導的DTX IC50值的增強,并且在HDAC1過表達或miR-200b抑制的情況下,由MARCSKL1–2過表達介導的DTX的IC50值降低得以恢復(圖3g,j)。總之,MARCKSL1–2通過抑制HDAC1或升高miR-200b來減弱LAD細胞中的DTX抗性。
4)MARCKSL1-2在LAD細胞中招募SUZ12
根據先前的報告,HDAC1/4缺失可以通過維持miR-200b啟動子處的組蛋白H3乙酰化來提高miR-200b的表達,從而逆轉LAD細胞的DTX抗性。基于此,我們假設MARCKSL1–2可以通過增強miR-200b啟動子處的組蛋白H3乙酰化水平來抑制HDAC1上調miR-200b。芯片分析顯示,MARCKSL1–2的減少抑制,而其上調增強了miR-200b啟動子的組蛋白-H3乙酰化水平(圖4a-b)。接下來,我們探討了MARCKSL1–2影響HDAC1轉錄的機制。我們采用RNA下拉和銀染色來分析與MARCKSL1-2相互作用的潛在蛋白質。我們發現SUZ12與MARCKSL1-2以高結合分數相互作用(圖4c)。此外,我們證實了SUZ12在親代和DTX抗性LAD細胞中的MARCKSL1–2下拉復合物中的存在(圖4d)。同時,RIP數據顯示,MARCKSL1–2在抗SUZ12組中高度富集,其在DTX抗性LAD細胞中的富集程度高于親本細胞(圖4e-f)。此外,我們檢測了MARCKSL1–2對SUZ12 mRNA水平和蛋白質水平的影響。結果表明,MARCKSL1–2不能影響不同LAD細胞中SUZ12的表達(圖4g-h)。這些結果表明,MARCKSL1–2在親代和DTX抗性LAD細胞中與SUZ12相互作用。
5)MARCKSL1-2通過招募SUZ12到HDAC1啟動子來影響 HDAC1的表達
SUZ12是PRC2復合物的關鍵亞單位,其調節靶基因的H3K27甲基化。因此,我們進一步探討了MARCKSL1–2是否通過招募SUZ12來調節HDAC1轉錄。我們首先分析了SUZ12對HDAC1的影響。我們發現SUZ12上調降低了SPC-A1和H1299細胞中HDAC1 mRNA和蛋白水平,而SUZ12的缺失導致H1299/DTX和SPCA1/DTX細胞中HDAC1水平升高(圖5a-b)。隨后,ChIP檢測顯示,HDAC1啟動子在親本和DTX耐藥LAD細胞SUZ12組均富集,且DTX耐藥細胞中HDAC1啟動子的富集量低于親本細胞(圖5c-d)。此外,HDAC1啟動子中的H3K27me3水平因SUZ12上調而增強,而在SUZ12下調時降低(圖5g)。更有趣的是,在SPC-A1和H1299細胞中,MARCKSL1–2敲除明顯減少了SUZ12組中HDAC1啟動子的富集,而在SPC-A1/DTX和H1299/DTX細胞中,當MARCKSL1–2上調時,HDAC1啟動子的富集增強(圖5f-g)。在MARCKSL1–2干擾下,HDAC1啟動子中的H3K27me3水平降低,但在MARCKSL1–2過表達時增加(圖5h)。這些結果表明,MARCKSL1–2通過招募SUZ12誘導HDAC1啟動子處的H3K27me3修飾來阻礙HDAC1的表達。
6)MARCKSL1-2通過調節HDAC1/miR-200b軸影響LAD細胞的DTX抗性
接下來,我們測試了MARCKSL1–2是否通過調節HDAC1和miR-200b來調節LAD細胞的DTX抗性。我們進行了功能實驗。集落形成和EdU分析的結果顯示,MARCKSL1–2敲除提高了H1299和SPC-A1細胞的增殖能力,并且在HDAC1抑制或miR-200b模擬下,升高的增殖被徹底逆轉。同時,在HDAC1上調或miR-200b抑制的情況下,受MARCKSL1–2上調阻礙的H1299/DTX和SPC-A1/DTX細胞的增殖能力完全恢復(圖6a-d)。流式細胞術和TUNEL分析的數據顯示,HDAC1敲低或miR-200b模擬可挽救因MARCKSL1-2缺失而對LAD細胞凋亡的抑制作用。相反,HDAC1過表達或miR-200b抑制完全消除了MARCKSL1-2上調對DTX抗性LAD細胞凋亡的增強作用(圖6e-h)。這些結果表明,MARCKSL1–2通過調節HDAC1/miR-200b軸減輕LAD細胞的DTX抗性。
7)MARCKSL1-2在體內減輕LAD腫瘤的DTX抗性
為了進一步驗證MARCKSL1–2在體內DTX耐藥性中的意義,我們構建了小鼠模型,并觀察了不同治療下小鼠的腫瘤生長情況。與對照組相比,MARCKSL1–2過表達或DTX治療組的腫瘤大小、體積和重量更小,并且在DTX治療的組中,MARCSKL1–2過表達導致上述參數進一步降低(圖7a-c)。因此, MARCKSL1–2在體內增強了LAD細胞對DTX治療的敏感性。
結論:我們的研究闡明了MARCKSL1–2/SUZ12/HDAC1/miR-200b軸在LAD細胞生長和DTX抗性中的抑制作用,表明MARCKSL2–2可能是改善LAD患者化療的一個有希望的靶點。
參考文獻:
Jiang M, Qi F, Zhang K, Zhang X, Ma J, Xia S, Chen L, Yu Z, Chen J, Chen D. MARCKSL1-2 reverses docetaxel-resistance of lung adenocarcinoma cells by recruiting SUZ12 to suppress HDAC1 and elevate miR-200b. Mol Cancer. 2022 Jul 21;21(1):150. doi: 10.1186/s12943-022-01605-w.