使用抗PD-1抗體的免疫檢查點(diǎn)阻斷治療已被證明對許多類型的癌癥有效。CD8+ T細(xì)胞腫瘤浸潤缺乏與患者對抗PD-1治療反應(yīng)差有關(guān)。理解腫瘤浸潤是如何調(diào)控的是提高治療效率的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)HRS磷酸化驅(qū)動PD-1+免疫抑制外泌體的分泌并限制CD8+ T細(xì)胞的腫瘤浸潤。本研究于2022年6月發(fā)表在《Nature Communications》IF：17.694期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗結(jié)果

1、ERK磷酸化HRS限制CD8⁺ T細(xì)胞浸潤至腫瘤

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體會影響腫瘤微環(huán)境和免疫系統(tǒng)。鑒于HRS在外泌體發(fā)生中扮演著重要作用，所以作者通過致癌激酶檢測了HRS在癌細(xì)胞中的潛在磷酸化。使用MS分析了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系WM9來源純化的HRS，鑒定到一個磷酸化的肽，即S345（圖1a）。S345與ERK共識磷酸化位點(diǎn)匹配。為了驗證ERK在S345磷酸化HRS，突變了這個位點(diǎn)。結(jié)果顯示突變體廢除了HRS被抗ERK磷酸化底物抗體識別的能力，而突變對照組則沒有廢除這種能力（圖1b）。在HEK293T細(xì)胞中構(gòu)建并純化Flag標(biāo)記的HRS然后將其和重組持續(xù)性激活ERK（CA-ERK）或激酶失活ERK（KD-ERK）孵育，結(jié)果顯示是CA-ERK而不是KD-ERK磷酸化HRS（圖1c），而使用ERK抑制劑SCH772984可以阻斷HRS磷酸化（圖1d），表明ERK可以直接磷酸化HRS。

基于HRS氨基酸序列，利用HRS磷酸化肽制備了一種抗體，使其能夠特異性識別S345位點(diǎn)磷酸化的HRS（p-HRSS345）。使用這種抗體利用黑色素瘤患者組織芯片檢測了p-HRSS345和CD8+ T細(xì)胞在腫瘤組織中的分布，結(jié)果顯示與低水平p-HRSS345腫瘤比較，具有高水平的p-HRSS345的腫瘤其CD8+ 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）水平較低（圖1e-f）。CD8+ TILs數(shù)量和p-HRSS345水平顯著負(fù)相關(guān)（圖1g），而和HRS總蛋白不相關(guān)（圖1h-i）。

在個體腫瘤中，p-HRSS345異質(zhì)性表達(dá)，CD8+ TILs在p-HRSS345高表達(dá)區(qū)域大幅減弱（圖1j）。IHC顯示在腫瘤-基質(zhì)交界處，當(dāng)p-HRSS345水平較高時，較少的CD8 + T細(xì)胞遷移到腫瘤組織中（圖1k-l）。總之，這些結(jié)果表明HRSS345磷酸化與黑色素瘤的CD8 + T細(xì)胞空間限制有關(guān)。

圖1 ERK磷酸化HRS限制CD8⁺ T細(xì)胞浸潤黑色素瘤

2、HRS磷酸化抑制TILs并誘導(dǎo)抗PD-1治療抗性

CD8+ T細(xì)胞浸潤和抗腫瘤免疫有關(guān)。為了探究HRS磷酸化是否與腫瘤細(xì)胞免疫抑制有關(guān)，構(gòu)建了HRS野生型（HRSWT）和HRS磷酸化缺失（HRSS345A）和HRS磷酸化模擬突變（HRSS345D）。流式顯示與HRSWT或HRSS345A比較，HRSS345D組腫瘤中PD-1 + CD8 + TILs的數(shù)量顯著下降（圖2a）。與HRSS345A比較，表達(dá)Ki-67和GranzymeB的CD8 + TILs的數(shù)量在HRSWT和HRSS345D中顯著下降（圖1b）。這些提示HRS抑制功能性CD8 + TILs的浸潤。

接下來探究HRS是否影響表達(dá)不同HRS突變體的黑色素瘤細(xì)胞的PD-1阻斷治療效果。結(jié)果顯示PD-1有效抑制表達(dá)HRSS345A的腫瘤生長，但這種抑制作用在HRSWT組減弱，在HRSS345D組幾乎被完全非常（圖2c）。這提示HRS誘導(dǎo)的免疫抑制阻礙了PD-1阻斷治療的效果，所以造成了一種可能，即抑制HRS磷酸化可增強(qiáng)PD-1阻斷的治療效果。為了驗證這種可能性，將抗PD-1和ERK抑制劑BVD-523聯(lián)合使用處理B16F10腫瘤，該腫瘤與YUMMER1.7黑色素瘤不同，其已知是對PD-1阻斷耐受的。結(jié)果顯示BVD-523增強(qiáng)了表達(dá)HRSWT組的CD8 + TILs的數(shù)量，稍微提高了HRSS345A組的T細(xì)胞浸潤，但不影響HRSS345D組，其是由于模擬的HRS磷酸化不能被ERK抑制改變；而BVD-523和PD-1聯(lián)合治療則導(dǎo)致HRSWT和HRSS345A組顯著的腫瘤抑制，但不影響HRSS345D組（圖2d-f）。這些結(jié)果表明BVD-523通過抑制HRS磷酸化發(fā)揮作用。

圖2 HRS^S345磷酸化阻斷CD8⁺ T細(xì)胞浸潤和降低抗PD-1治療效率

3、HRS磷酸化導(dǎo)致PD-L1選擇性富集至外泌體

接下來作者采用MS分析了表達(dá)不同HRS突變體的WM9細(xì)胞中分離出的sEVs的蛋白組成（圖3a-b）。HRSS345A組和HRSS345D組的sEVs的差異蛋白如圖3b-c所示，發(fā)現(xiàn)相比于HRSS345A組，PD-1在HRSS345D組的sEVs中顯著上調(diào)，WB實(shí)驗證實(shí)了這種上調(diào)趨勢（圖3d）。此外，BVD-523抑制HRS磷酸化，這減少了PD-L1加載至sEVs中（圖3e）。表明PD-L1通過HRS磷酸化被特異性裝載至外泌體。

此外，與HRSWT組比較，PD-1和MVEs（multivesicular endosomes）的共定位在HRSS345A組顯著下降在HRSS345D組顯著增加（圖3f-g）。免疫共沉淀表明PD-1和HRSS345D相互作用，但這種相互作用在S245突變后廢除，作為對照S245突變不影響HRS和STAM的相互作用（圖3h）。這些結(jié)果表明ERK介導(dǎo)的HRS磷酸化促進(jìn)PD-1募集至MVEs。映射實(shí)驗表明，缺乏泛素化相互作用基序（UIM）（a.a. 275-777）的HRS保留了與PD-L1結(jié)合的能力，而進(jìn)一步刪除a.a. 276-478則廢除了這種相互作用（圖3i-j）。鑒于S345位于PD-L1結(jié)合區(qū)域，因而這些結(jié)果表明，S345磷酸化特異性調(diào)節(jié)了泛素獨(dú)立排序。

圖3 HRS^S345磷酸化選擇性富集PD-L1至sEVs

4、HRS^S345D來源的sEVs有效抑制CD8⁺ T細(xì)胞浸潤

將不同HRS突變體來源的sEVs處理腫瘤小鼠，檢測腫瘤進(jìn)展，結(jié)果顯示表達(dá)PD-1的HRSWT和HRSS345D來源的sEVs處理顯著促進(jìn)PD-1敲除C57BL/6小鼠的腫瘤生長，而不影響Rag2 ?/?小鼠（圖4a-b）。CD8+ T細(xì)胞的腫瘤浸潤也被HRSWT和HRSS345D來源的sEVs顯著抑制（圖4c）。此外，與PBS和HRSS345A組比較，HRSWT和HRSS345D來源的sEVs顯著抑制CD8+ T細(xì)胞的增殖和激活（圖4d-e），以及細(xì)胞毒性（圖4g）。隨后采用RPPA檢測了不同HRS突變體來源的sEVs處理的CD8+ T細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)HRSWT和HRSS345D來源的sEVs顯著下調(diào)T細(xì)胞增殖和激活相關(guān)蛋白的表達(dá)，如FOXM1，urora A，ASNS，Cyclin-B1（圖4f）。

由于作者此前通過TEM觀察到腫瘤組織提取的sEVs經(jīng)常和ECM纖維結(jié)合，所以作者猜想sEVs與腫瘤細(xì)胞周圍的ECM結(jié)合來阻斷T細(xì)胞的浸潤。作者將CD8+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Rag2?/?小鼠中，并注射PD-L1-KO B16F10細(xì)胞與sEVs和Matrigel混合物，該細(xì)胞含有ECM成分，經(jīng)常用于體外模擬ECM。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的CD8+ T細(xì)胞浸潤被HRSWT和HRSS345D來源的sEVs抑制（圖4h），體外實(shí)驗也支持了該結(jié)果（圖4i）。這些數(shù)據(jù)表明，在腫瘤ECM中，HRS磷酸化的腫瘤來源的外泌體直接抑制CD8 + T細(xì)胞浸潤。

圖4 HRS磷酸化增強(qiáng)sEV對CD8⁺ T細(xì)胞的抑制作用

5、PD-L1富集的外泌體介導(dǎo)的CD8⁺ T細(xì)胞抑制是由HRS磷酸化誘導(dǎo)

鑒于HRS磷酸化的結(jié)果是PD-A在分泌的外泌體中富集而不改變細(xì)胞表面組成，作者接下來檢測了sEV PD-L1在pHRS誘導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞抑制中的作用。PD-L1-KO B16F10細(xì)胞分泌的HRSWT和HRSS345D來源的sEVs不影響CD8+ T細(xì)胞的毒性作用（圖5a），但是和PD-1抗體聯(lián)合使用則可以顯著抑制CD8+ T細(xì)胞的毒性作用（圖5b），抑制腫瘤生長（圖5c）和提高CD8+ T細(xì)胞的腫瘤浸潤（圖5d）。為了特異性檢測PD-1在體內(nèi)抑制sEV的作用，建立了一種利用CD8+ T亞群CD45.1+和CD45.2+的檢測方法，如圖5e所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與sEV S345A組比較，預(yù)處理sEV WT或sEVS345D的CD45.1+ CD8+ T細(xì)胞腫瘤浸潤的數(shù)量顯著降低，但該作用被PD-L1消除（圖5e）。鑒于PD-L1在sEV的富集可被ERK抑制劑BVD-523阻斷（圖3e），所以作者檢測了BVD-523處理腫瘤對sEV的影響。結(jié)果顯示BVD-523處理的sEV丟失了對T細(xì)胞激活、遷移、和細(xì)胞毒性的抑制作用；而sEVS345D的抑制作用則不能被BVD-523阻斷（圖5f-h）。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了HRS磷酸化調(diào)節(jié)外泌體對免疫抑制的抑制作用的結(jié)論。

圖5 PD-L1在外泌體富集介導(dǎo)的CD8⁺ T細(xì)胞抑制是由HRS磷酸化誘導(dǎo)

總之，本研究發(fā)現(xiàn)ERK介導(dǎo)的HRS S345磷酸化限制了CD8+ T細(xì)胞的腫瘤浸潤，HRS S345磷酸化是通過相互作用介導(dǎo)PD-L1進(jìn)入外泌體中，PD-L1富集的外泌體可抑制CD8+ T細(xì)胞的遷移和細(xì)胞毒性，從而發(fā)揮腫瘤免疫抑制作用。抑制HRS磷酸化可增強(qiáng)PD-1治療的效果。

參考文獻(xiàn)：

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