在膠質瘤惡性進展中，作者發現外泌體來源的circWDR62誘導膠質瘤細胞對替莫唑胺（TMZ）產生抗性并促進細胞增殖、遷移和侵襲潛能。體內和體外實驗表明，circWDR62通過調節miR-370-3p/MGMT軸促進膠質瘤惡性表型。本文于2022年7月發表在《Cell Death Disease》雜志上，IF=9.685。

技術路線圖

主要結果

1）在對TMZ抵抗的膠質瘤細胞中circWDR62表達水平上調。

首先，為探索對TMZ抵抗的膠質瘤細胞來源的外泌體中circRNA的表達，作者通過梯度誘導的方法成功地建立了穩定對TMZ抵抗的膠質瘤細胞系（附圖1A-F）并分離膠質瘤細胞來源的外泌體。透射電鏡表明由U343-R和U343細胞分泌的外泌體是圓形的（圖 1A）。外泌體濃度粒徑分析表明U343-R細胞分泌的外泌體（U343-R-exos）和U343細胞分泌的外泌體（U343-exos）的濃度分別為12.0×107/mL和8.6×107/mL；此外，大多數顆粒的直徑在50-250 nm；U343-R-exos和U343-exos直徑的中位值分別是142.4 nm和129.6 nm（圖 1B）。Western blot結果表明外泌體特異性標記CD63和TSG101在U343-R和U343細胞的外泌體表達（圖 1C）。這些結果證實成功提取到標準外泌體。為篩選對TMZ敏感的膠質瘤細胞和耐TMZ的膠質瘤細胞分泌的外泌體之間的差異表達的circRNA，作者對U343-R-exos和U343-exos進行了微陣列分析。火山圖結果提示與U343-exos相比，U343-R-exos中差異表達數千個circRNA（圖 1D）。Hsa_circ_0050688是其中表達水平最高的circRNA之一（圖 1E）。通過UCSC基因組數據庫，作者將circ_0050688的結構和定位進行可視化分析并發現其來源于宿主基因WDR62（圖1F）。此外，circPrimer軟件表明circ_0050688由WDR62基因的第8-15外顯子經反向剪接而形成。該circRNA成熟轉錄本的序列長度為1076 nt，作者稱為“hsa_circ_0050688”或“ circWDR62”（圖 1G）。此外，circWDR62能夠抵抗RNase R的消化；然而，經過RNase R處理后，WDR62 mRNA的表達水平顯著降低（圖1H）。qRT-PCR顯示，與原發腫瘤患者相比，來自復發的膠質瘤患者血清樣本的外泌體中circWDR62的表達顯著升高；膠質瘤患者中circWDR62的表達高于正常對照組(圖 1I)。如圖1J所示，復發性膠質瘤患者組織中circWDR62的表達高于原發性腫瘤患者。此外，Kaplan-Meier生存曲線顯示，circWDR62低表達組復發性膠質瘤患者的生存率高于高表達組（圖1K）。這些結果提示，外泌體circWDR62的高表達與膠質瘤的惡性進展有關。

附圖1 構建對TMZ抵抗的膠質瘤細胞

圖1在對TMZ抵抗的的神經膠質瘤中circWDR62的表達上調。

2）敲低circWDR62抑制膠質瘤細胞對TMZ的抗性和惡性進展。

進一步，為探索circWDR62的生物學功能，作者評估了circWDR62在U343-R和U251-R細胞以及對TMZ敏感的細胞中的表達水平。qRT-PCR數據顯示，與與對TMZ敏感的細胞及其分泌的外泌體相比，兩種耐TMZ的神經膠質瘤細胞系及外泌體中circWDR62的表達水平顯著增加（附圖2A&B）。由于circWDR62在TMZ耐藥細胞中的表達上調，因此構建circWDR62敲低模型用于評估其在膠質瘤細胞惡性表型中的作用（附圖2C）。敲低circWDR62降低了U343-R和U251-R細胞中TMZ的IC50、增殖活性、遷移和侵襲（附圖2D-G）。

附圖2敲低circWDR62抑制膠質瘤細胞對TMZ的抗性和惡性進展。

3）circWDR62通過充當miR-370-3p的海綿來促進神經膠質瘤細胞對TMZ的抗性和惡性表型

為了進一步闡明circWDR62的作用機理，作者通過circBank數據庫篩選篩選到circWDR62潛在的miRNA。作者專注于9種與神經膠質瘤惡性進展和TMZ耐藥性密切相關的miRNA，并具有強的結合潛能的miRNA作為后續篩查的關鍵研究對象。在這些miRNA中，miR-370-3p和circWDR62結合。Fish實驗表明，miR-370-3p和circWDR62共同定位于在U343-R和U251-R細胞胞質中（圖2A），這表明circWDR62可作為神經膠質瘤中的miRNA海綿。生物信息學分析預測了miR-370-3p和circWDR62之間潛在的結合位點（圖2B）。雙熒光素酶報告基因實驗表明，miR-370-3p mimics顯著抑制野生型circWDR62的熒光素酶的活性；但是對于突變型circWDR62的熒光素酶的活性沒有顯著的影響（圖2C）。這些數據表明在膠質瘤細胞中circWDR62可吸附miR-370-3p。

圖2 circWDR62通過充當miR-370-3p的海綿來促進TMZ耐藥和細胞增殖。

為探索circWDR62的海綿機制，作者設計了circWDR62 shRNA和miR-370-3p抑制劑。轉染sh-circWDR62后，顯著下調了U343-R和U251-R細胞中circWDR62的表達（圖1L）。然而，sh-circWDR62沒有顯著改變WDR62 mRNA表達（圖1M）。qRT-PCR分析表明，將miR-370-3p抑制劑轉染U343-R和U251-R細胞后miR-370-3p的表達中被下調（圖2D）。與陰性對照組相比，敲低circWDR62后顯著降低膠質瘤細胞的IC50，而miR-370-3p的抑制劑顯著增加了U343-R和U251-R細胞的IC50。然而，在U343-R和U251-R細胞中敲低circWDR62引起的調控作用可被共轉染miR-370-3p抑制劑削弱（圖2E）。細胞實驗表明，miR-370-3p抑制劑部分逆轉了因敲低circWDR62對膠質瘤細胞惡性表型的抑制作用，包括細胞增殖（圖2F）、遷移（圖3A）、侵襲（圖3B）、靶基因PCNA、增殖相關標記PCNA、EMT相關蛋白（圖3C-G）。

圖3 circWDR62通過充當miR-370-3p的海綿來促進細胞侵襲和遷移。

4）MGMT是膠質瘤中circWDR62/miR-370-3p軸的直接靶基因。

采用三個數據庫（miRDB, miRTarBase, and TargetScan）預測miRNA的潛在靶標mRNA。維恩圖顯示23個mRNA是miR-370-3p的最可能靶基因（圖4A）。進一步，敲低circWDR62后作者檢測了潛在靶基因的表達水平。結果表明FOXO1表達沒有顯著變化（圖4B）和MGMT表達降低（圖4C）。如圖4D所示，生物信息學預測miR-370-3p和MGMT之間潛在的結合位點。與TMZ敏感的神經膠質瘤細胞相比，在TMZ耐藥神經膠質瘤細胞中MGMT的蛋白質表達上調（圖4E）。此外，GEPIA2數據庫表明MGMT高表達與神經膠質瘤患者的總生存率較低有關（圖4F）。此外，Fish結果表明，在U343-R和U251-R細胞中，miR-370-3p和MGMT共定位在細胞質（圖4G）。

圖4 MGMT是膠質瘤中circWDR62/miR-370-3p軸的直接靶基因。

進一步，挽救性實驗證實過表達MGMT顯著逆轉了敲低circWDR62引起的膠質瘤細胞對TMZ抗性的抑制作用（圖5A）。此外，MGMT過表達削弱了敲低circWDR62引起對膠質瘤細胞惡性表型的抑制作用，包括增殖、遷移和侵襲（圖5B-D）。

圖 5 MGMT過表達逆轉了circWDR62敲低誘導的TMZ耐藥性和神經膠質瘤細胞的惡性進展。

5）circWDR62增強了膠質瘤TMZ耐藥性和體內腫瘤的生長

為了在體內研究膠質瘤中circWDR62和TMZ抗性之間的關系，作者構建動物模型。每3天將TMZ注射到裸鼠體內。轉染shRNA-circWDR62組的腫瘤顯著小于對照組（圖6A）。兩組小鼠的體重沒有顯著性的差異（圖6B）。然而，無論TMA處理如何，敲低circWDRE62顯著抑制腫瘤體積和重量（圖6C&D）。另外，與shRNA-NC組相比，在shRNA- circWDR62組中，腫瘤組織中circWDR62的表達被下調（圖6E）。此外，WB分析證實，shRNA- circWDR62組中MGMT蛋白表達顯著低于對照組（圖6F）。

圖6 CircWDR62增強膠質瘤細胞TMZ耐藥性和體內腫瘤的生長。

6）在體外和體內外泌體介導的cirwDR62的傳遞誘導膠質瘤的TMZ耐藥性和惡性進展

隨后，將PKH67標記的TMZ抗膠質瘤細胞分泌的外泌體與TMZ敏感的膠質瘤細胞共培養（圖7A）。可以觀察到對TMA敏感的膠質瘤細胞攝取了對TMZ抵抗的膠質瘤細胞分泌的外泌體（圖7B）。qRT-PCR分析結果表明，經過對TMZ抵抗的膠質瘤細胞衍生的外泌體處理后，對TMZ敏感的膠質瘤細胞后中cirwDR62的表達水平顯著升高，并且隨著外泌體的濃度增加，在TMZ敏感的神經膠質瘤細胞中的表達水平顯著升高（圖 7C）。但是，在添加GW4869（外泌體分泌阻滯劑）后，在Transwell共培養系統中cirwDR62的表達顯著降低（圖7D）。這些結果表明，來自于抗TMZ的膠質瘤的circWDR62可經由外泌體傳遞到對TMZ敏感的膠質瘤細胞中。進一步，細胞功能實驗表明經過來源于對TMZ抵抗的膠質瘤細胞所分泌的外泌體處理后，U343和U251細胞的增殖、遷移和侵襲潛能顯著增強（圖7E-G）。

圖7外泌體介導的cirWDR62遞送可在體外誘導膠質瘤細胞的TMZ耐藥性和惡性進展。

體內實驗的結果表明，經過U343-R來源的外泌體處理后，U343組的腫瘤大小、體重和體積顯著高于對照組；但是兩組中小鼠的體重沒有顯著差異（圖8A-D）。此外，與U343組相比，U343+U343-R-exo組中circWDR62的表達水平顯著上調（圖8E）。因此，circWDR62可以通過外泌體在TMZ抗性和TMZ敏感的神經膠質瘤細胞之間運輸。來自TMZ耐藥的細胞的外泌體circWDR62在受體敏感細胞中賦予了TMZ耐藥性，同時還增強了受體敏感細胞的細胞增殖，遷移和侵襲。總而言之，這些結果表明外泌體來源于circWDR62通過吸附miR-370-3p來調節MGMT表達，從而導致質瘤的TMZ耐藥性和惡性進展（圖8F）。

圖8外泌體介導的cirWDR62傳輸可誘導體內神經膠質瘤的TMZ耐藥性和惡性進展。

參考文獻

Xiuchao Geng, Yuhao Zhang, Xiaomeng Lin, Zhaomu Zeng, Jun Hu, Liangchao Hao, Jianglong Xu,  Xinjuan Wang, Hong Wang, Qiang Li. Exosomal circWDR62 promotes temozolomide resistance and malignant progression through regulation of the miR-370-3p/MGMT axis in glioma. Cell Death Dis. 2022 Jul 11;13(7):596. doi: 10.1038/s41419-022-05056-5.