大量研究表明circRNA和m6A甲基化修飾參與了包括肝細胞癌（HCC）在內的多種惡性腫瘤的病理進展和轉移。但是circRNA如何和m6A甲基化修飾形成發聵環作用于HCC進展尚不清楚。本研究證實circGPR137B通過circGPR137B/miR-4739/FTO反饋環促進HCC的腫瘤發生和轉移。這種通過circRNA和m6a修飾事件之間的功能耦合執行的正反饋機制為表觀遺傳學提供了一種新的模型機制。本研究于2022年6月發表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技術路線

主要實驗結果：

1、circGPR137B下調和HCC患者的不良預后相關

對3對HCC腫瘤組織和配對癌旁組織進行測序，其差異表達circRNA熱圖如圖1A所示，在P < 0.05和FC > 1.5的標準篩選后，在HCC中得到96個上調和51個下調的circRNA（圖1B）。火山圖顯示hsa_circ_0017114，一個來源于線性RNA GPR137B的circRNA，在HCC中顯著下調表達，將其命名為circGPR137B（圖1C）。circRNA表達譜和RT-qPCR均表明相比于癌旁組織circGPR137B在HCC中下調（圖1D-1E）。隨后在87對HCC和癌旁組織中進一步證實了這個結果（圖1F-1G）。預后分析發現和circGPR137B高表達組比較，circGPR137B低表達組具有較差的生存預后（圖1H-1I）。以上結果表明circGPR137B下調和HCC患者的不良預后相關。

圖1 circGPR137B下調和HCC患者的不良預后相關

2、HCC細胞中circGPR137B的特征

hsa_circ_0017114來源于14q1(q42.3)染色體上GPR137B的外顯子1，7區域，命名為circGPR137B，其基因組序列是40204nt，剪切長度是1537nt（圖2A）。HepG2和Hep3B細胞在RNase R中暴露2小時，發現GPR137B的表達顯著下降而circGPR137B的表達因其抗性而無明顯改變（圖2B）。隨后探究了circGPR137B在actinomycin D暴露中的穩定性，結果顯示circGPR137B的半衰期顯著長于GPR137B（圖2C）。RT-qPCR和FISH實驗表明HCC組織中circGPR137B主要定位于染色質（圖2D-2E）。

圖2 HCC細胞中circGPR137B的特征

3、在體外circGPR137B抑制HCC細胞的生長和侵襲

作者檢測了6株HCC細胞系中circGPR137B的表達，結果發現與正常肝細胞系比較，其在SK-hep-1細胞系中表達最高，在Hep3B中的表達最低（圖3A）。所以后續在SK-hep-1細胞系中進行circGPR137B的敲低實驗，在Hep3B中進行circGPR137B過表達實驗（圖3B）。MTT，集落形成和Transwell實驗顯示circGPR137B過表達HCC細胞的生長和侵襲，circGPR137B敲低則效果相反（圖3C-3E）。以上表明circGPR137B在HCC中發揮抑癌作用。

圖3在體外CircGPR137B抑制細胞生長

4、在HCC中miR-4739的表達和circGPR137B負相關和HCC不良預后相關

基于circRNA表達譜和miRbase在線預測發現circGPR137B擁有5個潛在結合的miRNA（圖4A），它們的結合位點如圖4B所示。雙熒光素酶實驗結果顯示circGPR137B的熒光素酶活性只在miR-4739 mimics處理時顯著降低而非另外4個miRNA（圖4C）。FISH結果顯示相比于癌旁組織miR-4739的表達在HCC中顯著上調（圖4D-4E），并且miR-4739表達和circGPR137B顯著負相關（圖4F）。TCGA數據也證實miR-4739表達在HCC中顯著上調，且和不良預后相關（圖4G-4H）。以上說明HCC中miR-4739高表達且預示不良預后。

圖4 在HCC中CircGPR137B與miR-4739呈負相關

5、在HCC中circGPR137B是miR-4739的海綿

基于上述結果作者選擇miR-4739用于進一步實驗。過表達circGPR137B顯著降低miR-4739的表達（圖5B）。此外，野生型circGPR137B和miR-4739的結合位點如圖5A所示，同時構建了結合位點突變的circGPR137B熒光素酶報告基因載體。結果顯示在野生型中，circGPR137B的熒光素酶活性在miR-4739過表達組顯著降低，但是miR-4739突變后不改變，此外，在circGPR137B突變體中，miR-4739過表達不影響circGPR137B的熒光素酶活性（圖5C）。AGO2-RIP顯示和對照組比較內源性circGPR137B和miR-4739的富集可被Ago2抗體拉下（圖5D）。FISH分析發現circGPR137B和miR-4739具有明顯的細胞質共定位（圖5E）。此外，細胞功能實驗表明miR-4739過表達可顯著抵消circGPR137B過表達對HepG2和Hep3B細胞增殖和侵襲的抑制效果（圖5F-5G）。這些結果表明在HCC中circGPR137B可靶向調控miR-4739。

圖5 在HCC中circGPR137B是miR-4739的海綿

6、在HCC中circGPR137B/miR-4739軸上調FTO

根據TargetScan7.1的結果，FTO可能是miR-4739的靶基因（圖6A）。熒光素酶實驗證實FTO和miR-4739可相互結合（圖5B），并且miR-4739過表達可顯著降低FTO，p21，p27，caspase-3/9和E-cadherin的表達，升高N-cadherin和vimentin的表達（圖6C-6D）。此外，miR-4739過表達也可逆轉circGPR137B對上述基因表達的影響。共轉染FTO質粒和miR-4739 mimics后可觀察到FTO過表達顯著阻止了miR-4739過表達帶來的促腫瘤作用（圖6E-6G）。這些結果提示在HCC中circGPR137B/miR-4739軸上調FTO。

圖6 在HCC中circGPR137B/miR-4739軸上調FTO

隨后作者分析了FTO在HCC中的表達模式和預后價值，結果和預期一致，FTO表達在HCC組織中顯著下降，且FTO下調與HCC預后不良有關（圖7）。

圖7 FTO下調提示HCC預后不良

7、FTO介導circGPR137B的m6A修飾與circGPR137B形成正反饋環路

此前有研究表明腫瘤中circRNA會發生m6A修飾，而FTO是去甲基化酶，所以作者猜想FTO是通過介導circGPR137B的m6A修飾參與HCC進展。在HepG2和Hep3B細胞中，過表達FTO均可顯著降低總體的m6A水平（圖8A-8B）以及circGPR137B的m6A水平（圖8C），但顯著增加了circGPR137B的表達水平（圖8D）。敲低FTO則降低circGPR137B的表達（圖8E）。此外，敲低circGPR137B的表達也可顯著增加miR-4739的表達增加FTO的表達（圖8F），而miR-4739抑制劑處理則增加FTO的表達（圖8G）。RIP實驗揭示FTO可以結合circGPR137B（圖8H）。重要的是，敲低circGPR137B可顯著逆轉FTO過表達引起的抗腫瘤效果（圖8I-8J）。以上說明，FTO介導circGPR137B的m6A修飾與circGPR137B形成正反饋環路調控HCC進展。

圖8 FTO介導circGPR137B的m6A修飾與circGPR137B形成正反饋環路

8、在體內circGPR137B抑制HCC腫瘤發生和轉移

如圖9和圖10所示，過表達circGPR137B顯著增加HCC腫瘤的體積和重量，促進病理性改變，增加腫瘤增殖和FTO表達，同時也顯著促進HCC細胞的肺轉移結節形成，而敲低circGPR137B表達則效果完全相反。表明在體內circGPR137B抑制HCC腫瘤發生和轉移。

圖9 CircGPR137B抑制體內HCC腫瘤發生

圖10 CircGPR137B抑制體內HCC的肺轉移

綜上所述，本研究證實circGPR137B通過正反饋回路抑制肝癌的增殖和轉移。CircGPR137B 通過海綿吸附 miR-4739 誘導 FTO表達。FTO蛋白進入細胞核介導circGPR137B的m6A去甲基化并促進其表達，因此，對circGPR137B 產生形成正反饋，從而強烈抑制肝癌細胞增殖、集落形成、侵襲和肺遷移。

圖11本研究的機制模擬圖

參考文獻：

Liu Lianyong., Gu Mingjun., Ma Junhua., Wang Ying., Li Miao., Wang Hui., Yin Xin., Li Xiangqi.(2022). CircGPR137B/miR-4739/FTO feedback loop suppresses tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Mol Cancer, 21(1), 149. doi:10.1186/s12943-022-01619-4