小細胞肺癌(SCLC)是一種具有高度侵襲性和致命性的肺癌亞型，盡管化療取得了顯著進展，但SCLC患者幾乎在一年內復發，預后相當差，5年生存率低于7%。多項證據表明，circRNAs (circRNAs)在各種人類癌癥中發揮致癌或抑制腫瘤的作用。然而，circRNA在小細胞肺癌(SCLC)中的生物學功能仍不明確。為了闡明circRNA在SCLC腫瘤發生中的功能，對SCLC組織和SCLC患者血清中差異表達的circRNAs進行生物信息學分析。

1、 circVAPA在SCLC中的鑒定

基于之前已報道的SCLC中CircRNA表達模式和以及118名正常人和SCLC患者RNA-seq數據分析，發現circVAPA是一種顯著上調的circRNA(Fig. 1A)。分析circVAPA在肺癌細胞系和人原發性SCLC組織中的表達。發現與對照組相比，3對SCLC組織中內源性circVAPA顯著升高(Fig. 1C)。同樣，circVAPA在SCLC細胞系中的表達明顯高于NSCLC細胞系(Fig.1D)，提示circVAPA是SCLC中顯著上調的circRNA，值得進一步研究。DMS273和H82細胞系中circVAPA表達水平最高，于是選擇了SCLC細胞系DMS273和H82進行后續實驗。circBase數據庫顯示CircVAPA從vamp相關蛋白A (VAPA)基因的2-4外顯子反剪接而來，全長338個核苷酸(nt)。 VAPA基因外顯子2-4的環狀化通過頭尾連接形成了circVAPA。用RT-PCR驗證circVAPA的存在(Fig. 1E)。RT-qPCR檢測RNase R外切酶，證實circVAPA耐消化(Fig. 1F, G), 符合circRNA的特征。為了進一步評價circVAPA的穩定性，放線菌素D(一種轉錄抑制劑)處理實驗顯示，在SCLC細胞中，circVAPA比VAPA mRNA更穩定(Fig. 1H, I)。以circVAPA后接位點為靶點的FISH檢測和對細胞核和細胞質RNA的qPCR分析顯示，在DMS273和H82細胞中，circVAPA均在細胞質中富集(Fig. 1J, K)。

Fig1 circVAPA在SCLC中的鑒定

2、CircVAPA在體外促進SCLC進展

兩個針對circVAPA后剪接位點的獨立siRNA導致了SCLC細胞中circVAPA的有效沉默，而VAPA mRNA沒有顯著變化(Fig. 2A)。CTG熒光實驗顯示，circVAPA被任一siRNA敲低都會降低SCLC細胞的活力(Fig. 2B)。隨后，siRNA介導的circVAPA抑制導致SCLC細胞集落形成減少(Fig. 2C)。流式細胞術分析顯示，circVAPA耗盡導致SCLC細胞G0/G1周期阻滯，SCLC細胞凋亡比例增加(Fig 2D,E)。同時，WB檢測的SCLC細胞中，circVAPA敲低后p21和cleaved PARP蛋白水平顯著升高(Fig 2F).

Fig 2 circVAPA干擾抑制SCLC細胞集落形成

3、CircVAPA在體外促進SCLC進展

此外，作者構建了過表達的circVAPA (OE-circVAPA)。如圖3A所示，OE-circVAPA顯著增加了circVAPA的表達，且沒有改變SCLC細胞中VAPA mRNA水平的變化。與circVAPA沉默的效果相反，過表達circVAPA有助于SCLC細胞的細胞活力、集散形成和細胞周期進程的增加，凋亡細胞比例和p21和cleaved PARP蛋白水平的降低(Fig 3B-F)。總的來說，作者的結果得出的結論是，circVAPA促進了體外SCLC進展。

Fig 3 CircVAPA在體外促進SCLC進展

4、CircVAPA是miR - 3773p和miR - 4943p的海綿

采用Ago2 RNA免疫沉淀(RIP)驗證circVAPA在DMS273細胞中的結合(Fig 4A)。RIP實驗證實Ago2與circVAPA和circHIPK3(陽性對照)直接結合，而與EIciPAIP2(陰性對照)不結合(Fig 4B)。

然后作者使用了CircInteractome來預測circVAPA假定的miRNA結合位點。如圖4C所示，circVAPA序列中預測了14個假定的miRNA結合位點，其中，miR-494-3p有兩個潛在的結合位點。然后，合成了circVAPA連接位點反義的生物素標記的寡核苷酸探針，并進行RNA下拉實驗，進一步證明miRNA-circVAPA可能存在相互作用(Fig. 4D)。與對照探針相比，反義探針能夠有效且精確地捕獲內源性circVAPA，并下拉的miR-377-3p和miR-494-3p，但沒有其他12種預測miRNAs(Fig. 4E)。此外，Ago2 RIP的RT-qPCR分析表明，在DMS273細胞中，miR-377-3p或miR-494-3p與相應的mimic過表達后，circVAPA富集顯著(Fig. 4F)。此外，作者構建了熒光素酶報告基因質粒，將circVAPA的線性序列或假設的miR-377-3p或miR-494-3p結合位點突變的序列融合到熒光素酶的3 ' UTR上。雙熒光素酶報告基因實驗驗證了293T細胞中circVAPA與miR-377-3p/miR-494-3p的直接結合(Fig. 4G)。值得注意的是，circVAPA中兩個假定的miR-494-3p結合位點對它們的相互作用都是必需的(Fig. 4G)。在siRNA介導的circVAPA敲低后，DMS273和H82細胞中miR-377-3p和miR-494-3p的表達水平顯著升高，而circVAPA過表達導致miR-377-3p和miR-494-3p的水平下降(Fig.4)。

重要的是，作者證明了抑制miR-circVAPA衰竭細胞中的377-3p或miR-494-3p可以挽救circVAPA敲低對DMS273和H82細胞活力和集落形成的抑制作用(Fig. 4H, I)。相反，miR-377-3p或miR-494-3p過表達消除了circVAPA過表達對DMS273和H82細胞活力和集落形成的促進作用(Fig.4J, K)。這些結果表明，circVAPA在SCLC細胞中充當了miR-377-3p和miR-494-3p的分子海綿。377-3p或miR-494-3p過表達消除了circVAPA的促進作用。

        Fig4 CircVAPA是miR - 3773p和miR - 4943p的海綿

5、IGF1R是miR - 3773p和miR - 4943p的功能靶標

由于circVAPA可以作為ceRNA作用于miR-377-3p和miR-494-3p，作者開始確定miRNA的下游靶點。通過兩個數據庫對miR-377-3p和miR-494-3p的潛在靶點進行預測，發現miR-377-3p和miR-494-3p共享41個共同候選基因(Fig. 5A）。對數據集(GSE149507)和41個常見候選SCLC中顯著上調的靶基因進行整合分析，最終聚焦于10個潛在靶基因。IGF1R是SCLC中不可或缺的角色，進一步證實發現它是miR-377-3p和miR-494-3p的唯一共同靶點，轉染miR-377-3p/miR-494-3p模擬物和抑制劑。通過雙熒光素酶報告基因實驗，作者進一步揭示了miR-377-3p/miR-494-3p在分子水平與野生型IGF1R mRNA結合，但在293T細胞中miR-377-3p/miR-494-3p的假設結合位點未與攜帶突變的IGF1R mRNA結合(Fig. 5B, C)。值得注意的是，只有位點2挽救了miR-494-3p誘導的熒光素酶活性抑制作用(Fig.5C)。接下來，作者檢測了miR-377-3p/miR-494-3p和IGF1R的表達，SCLC臨床標本中發現miR-377-3p/miR-與paraSCLC相比，SCLC中494-3p均下調，而IGF1R mRNA則呈現相反趨勢(Fig.5D, E)。

此外，沉默miR -377-3p/miR-494-3p及其相應的抑制劑在mRNA和蛋白水平上顯著提高了DMS273和H82細胞中IGF1R的表達(Fig.5F, H和Fig.6A)。相反，miR-377-3p和miR-494-3p及其模擬物過表達顯著降低了SCLC細胞中IGF1R的mRNA和蛋白水平(Fig.5G、I，Fig.6B)。這些結果表明，IGF1R是miR-377-3p和miR-494-3p的直接和功能靶點。

Fig 5 IGF1R是miR-377-3p和miR-494-3p的直接和功能靶點。

6、CircVAPA通過miR - 3773p & miR - 4943p /IGF1R/AKT軸促進SCLC細胞活力

為了檢測circVAPA是否作為靶向miR-377-3p和miR-494-3p的ceRNA來調控IGF1R的表達水平，作者采用雙熒光素酶報告基因實驗來評估circVAPA與miR-377-3p和miR-494-3p以及IGF1R之間的相互作用。結果發現，異位circVAPA過表達逆轉了miR-377-3p和miR-494-3p過表達對熒光素酶活性的抑制，表明在circVAPA作為ceRNA對抗miR-377-3p和miR-494-3p，解除對IGF1R表達的抑制(Fig. 6E）。

接下來探索circVAPA是否通過miR-377-3p和miR-494-3p/IGF1R軸調控PI3K/AKT信號通路，促進SCLC進展。首先，作者證明了S6核糖體蛋白(p-S6RP) ，miR-377-3p或miR-494-3p抑制劑可以挽救IGF1R及其下游靶點磷酸化AKT (p-AKT)和磷酸化的S6核糖體蛋白(p-S6RP) 的mRNA和蛋白水平的下降(Fig. 5F, H，Fig. 6A）。值得注意的是，根據作者之前報道的研究，在H82細胞中，p-AKT水平太低，無法通過western blot檢測到。相反，circVAPA對IGF1R mRNA、IGF1R蛋白、p-AKT和p-S6RP蛋白表達的促進作用可以被miR-377-3p或miR-494-3p模擬物消除(Fig. 5G, I ,Fig. 6B)。重要的是，IGF1R已被證明是一個潛在的靶點，并抑制IGF1R在SCLC細胞中表達，表現出良好的抗腫瘤作用。通過siRNA或BMS-536924抑制IGF1R抑制劑，能恢復circvapa誘導的細胞活力、集散形成、IGF1R mRNA以及IGF1R、p-AKT和p-S6RP的蛋白水平(Fig. 5J-L, Fig. 6C, D)。 IHC染色顯示，與paraSCLC相比，SCLC中IGF1R和p-AKT蛋白水平均上調(Fig. 6F, G)。綜合這些結果表明，circVAPA通過隔離miR-377-3p和miR-494-3p激活IGF1R/AKT軸促進SCLC細胞活力和集合體形成。

Fig6 CircVAPA通過miR - 3773p & miR - 4943p /IGF1R/AKT軸促進SCLC細胞活力

7、CircVAPA通過調控IGF1R在體內和體外促進SCLC增殖

BMS-536924，一種靶向IGF1R的小分子抑制劑，已被證實可以抑制IGF1R磷酸化并阻斷IGF1R介導的AKT信號級聯。添加BMS-536924可以減弱p-AKT和p-S6RP蛋白的表達，但這種對AKT信號級聯的負調控在circVAPA過表達時減弱(Fig 6d)。此外，作者用慢病毒shRNA建立了DMS273穩定細胞系來沉默circVAPA。添加BMS-536924或抑制circVAPA的處理對AKT信號級聯的降低顯示出中等的影響，而兩者的聯合處理顯示出最大的抑制效果(Fig. 7A)。為了支持WB結果，單獨添加BMS-536924或沉默circVAPA對DMS273和H82的細胞活力和克隆形成有明顯的阻斷作用(Fig. 7B, C)。然而，聯合使用BMS-536924處理和減少circVAPA對DMS273和H82的細胞活力和克隆形成有最大的抑制作用(Fig.7B, C)。

為了探討circVAP在SCLC體內的生物學功能，然后作者進行皮下注射circVAPA敲除和對照DMS273細胞裸鼠，以研究circVAPA在體內的作用。與對照組相比，circVAPA穩定敲除的細胞形成的腫瘤體積、體積和重量都明顯更小(Fig.7D-F)。免疫組化染色顯示，與對照組相比，來自circVAPA穩定敲低的細胞的腫瘤中Ki67、IGF1R、p-AKT水平顯著降低 (Fig.7G)。IGF1R抑制劑BMS-536924在體外表現出增強了circVAPA沉默引起的對細胞活力、集散形成、p-AKT和p-S6RP的抑制作用，以及體內腫瘤大小、體積和重量的抑制作用，表明BMS-536924和circVAPA損耗可能在SCLC治療中實現潛在的協同作用(Fig.7A-G)。這些結果表明，在體內，circVAPA通過靶向IGF1R，促進SCLC增殖體內。

Fig7 CircVAPA通過調控IGF1R在體內和體外促進SCLC增殖

總之，本研究提出circVAPA/miR-377-3p和miR-494-3p/IGF1R/AKT軸可能是SCLC的一個有效治療靶點，為SCLC進展的機制提供新的見解。