細胞質中鐵離子分子伴侶PCBP1是一個多功能的RNA結合蛋白，參與基因的轉錄，RNA的調控，和鐵離子加載至鐵蛋白的過程。PCBP1也是眾所周知的自噬抑制分子，但是PCBP1在鐵自噬和鐵死亡中的作用尚未可知。因此，本研究旨在探究PCBP在鐵自噬介導的鐵死亡在頭頸癌中的作用。本研究于2022年5月發表在《Redox Biology》IF：11.799期刊上。

技術路線：

主要研究結果

1、PCBP1的表達和HNC的存活及鐵死亡敏感性有關

作者通過TCGA分析發現PCBP1的表達在正常和HNC腫瘤組織中無差異，但是低表達PCBP1的患者總體生存率顯著更高。此外，PCBP1低表達的細胞對erastin的敏感性更高，表現為在同濃度erastin處理下，PCBP1低表達的細胞比PCBP1高表達細胞的活力更低、死亡更多、經歷脂質過氧化的細胞比例更高、LIP更高（附圖1C-1I）。但是這些作用可以被ferrostatin-1或deferoxamine減緩（附圖1J）。這些結果表明PCBP1表達和HNC的存活及鐵死亡敏感性有關。

附圖1 PCBP1的表達和HNC的存活及鐵死亡敏感性有關

2、敲除PCBP1增加HNC細胞對鐵死亡的敏感性

隨后作者通過PCBP1的功能丟失實驗驗證PCBP1與HNC細胞對鐵死亡敏感性的關系。在PCBP1高表達的HN3，HN6，HN12的細胞中敲除PCBP1，結果發現細胞內總鐵和亞鐵含量、LIP、ROS和細胞死亡均顯著增加，但重新表達PCBP1可以減輕上述影響（圖1A-1J）。隨著PCBP1的敲除，鐵穩態相關分子表達水平發生變化，FTH1和FPN表達下調，而DMT1和TFRC表達上調（圖1K-1L）。這些結果表明PCBP1敲除通過細胞內亞鐵積累促進細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性。

圖1敲低PCBP1增加HNC細胞對鐵死亡的敏感性

3、PCBP1負調控BECN1 mRNA

PCBP1作為RNA調節因子在翻譯過程中起著重要作用。作者通過RBP圖譜分析了BECN1 mRNA的序列，以確定PCBP1的結合區域，結果顯示預測的PCBP1的結合區域位于BECN1 mRNA的3’UTR區域（圖2A）。用于熒光素酶檢測的BECN1 mRNA片段就是從這一發現中產生的（圖2B-2C）。隨著pcDNA 3.1-PCBP1的引入，pLFL(全長片段)和pLF2(包括PCBP1結合區)的熒光素酶活性降低（圖2D）。pull-down驗證了PCBP1和BECN1的結合（圖2E）。以上提示PCBP1負調控BECN1 mRNA。

圖2 PCBP1使BECN1 mRNA失去穩定性

4、敲除PCBP1增強了鐵自噬誘導性

使用erastin處理的情況下，與對照組比較，PCBP1敲除的細胞中自噬斑點（及與亞鐵共染斑點）數量增加、細胞活力下降、細胞內亞鐵含量增加（圖3A-3C）；此外，PCBP1敲除細胞中LC3B-II、Atg5和4-HNE表達增加，而p62、NCOA4和鐵蛋白表達減少，然而，使用巴菲霉素A1處理細胞后，LC3B-II和p62表達增加（圖3D）。PCBP1基因的敲除可顯著增加細胞中亞鐵含量和共染色點狀體的數量（圖3E-3F）。這些結果表明PCBP1阻礙了鐵自噬體的鐵離子釋放。

圖3 敲除PCBP1增強了鐵自噬誘導性

作者此前的研究發現鐵離子過載進入線粒體后會導致線粒體功能異常。此外，PCBP1敲除后，TMRE顯著下降，線粒體超氧化物和亞鐵染色強度顯著增加（附圖5）。這些研究表明PCBP敲除導致線粒體功能異常是通過增加鐵離子過載進入線粒體。

附圖5 鐵自噬引起的鐵離子過載導致線粒體功能異常。

5、PCBP1負調控脂質過氧化

PCBP1還可以特異性調控ALOX15的3’端翻譯，ALOX15是氧化生成PUFA的關鍵分子。因此，作者接下來探究敲除PCBP1是否會導致氧化PUFA的增加。結果顯示，敲除PCBP1增加了細胞內脂質、氧化PUFA、游離脂肪酸水平、相關分子的表達、MDA和4-HNE水平（附圖6）。當細胞暴露于erastin或sulfasalazine時，與油酸(10 μM)相比，亞油酸(10 μM)作用時細胞活力顯著降低（附圖6F）。在PCBP1敲低的細胞中，FASN、FADS2、SCD1和SREBP1增加，在PCBP1過表達的細胞中減少（附圖6H）。這些結果表明，敲除PCBP1通過激活脂肪酸合成和ALOX15表達，促進了PUFA的生成和脂質過氧化。

附圖6 PCBP1負調控脂質過氧化

6、PCBP1敲除增加了腫瘤的鐵死亡易感性

最后，作者在體內檢測敲除PCBP1是否會增加鐵死亡易感性。PCBP1-抑制組(HN12 shPCBP1)和PCBP1-過表達組(HN2 PCBP1質粒)的腫瘤生長速度均高于載體對照組（圖4A-4C）。此外，施用sulfasalazine顯著抑制腫瘤生長：在HN12 shPCBP1中更顯著。細胞內鐵離子含量，脂質含量和脂質過氧化積累在HN12 shPCBP1腫瘤中更高，并且sulfasalazine處理后更高（圖4D-4F）。在PCBP1抑制或低表達組中，經sulfasalazine處理后ACSL4、ALOX15、4-HNE和PTGS2的表達增加，而FTH1和NCOA4的表達降低，但在PCBP1過表達組則相反（圖4G）。因此，PCBP1敲除有助于體內鐵死亡敏感性的增加。

圖4 PCBP1敲除增加了腫瘤的鐵死亡易感性

參考文獻

Lee Jaewang., You Ji Hyeon., Roh Jong-Lyel.(2022). Poly(rC)-binding protein 1 represses ferritinophagy-mediated ferroptosis in head and neck cancer. Redox Biol, 51(undefined), 102276. doi:10.1016/j.redox.2022.102276