多形性膠質母細胞瘤（GBM）是最致命的原發性腫瘤。研究GBM血管生成的新分子機制非常重要。研究發現，M2小膠質細胞極化與GBM患者微血管密度呈正相關。M2-膠質瘤相關的小膠質細胞（GAM）可通過將外泌體circKIF18A轉運到hBMECs中促進GBM的血管生成。在機制上，circKIF18A可以結合hBMECs中FOXC2，維持其穩定性和核易位。此外，作為一種轉錄因子，FOXC2可以直接與ITGB3、CXCR4和DLL4的啟動子結合并上調其表達。此外，FOXC2還可以激活PI3K/AKT信號，促進GBM的血管生成。我們的研究確定了M2-GAM衍生外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2參與GBM血管生成的新分子機制。這可能為改善GBM抗血管生成治療的療效提供一個新的治療靶點。本文于2022年5月發表于Oncogene（IF=8.756）上。

技術路線

結果

1）M2小膠質細胞與GBM患者微血管密度相關

首先，我們分析了TCGA、CGGA、Rembrandt和Gravendel數據庫，發現M2極化標記基因（CD163、CD206、ARG1）和血管生成相關基因（CD31、CD34、vWF）之間存在正相關（圖1A）。基于TCGA和CGGA數據庫的GSEA和GSVA分析表明，CD163高表達組富含血管生成過程和信號傳導（圖1B、C）。此外，Kaplan-Meier生存分析表明，在TCGA、Rembrandt和Gravendel數據庫中，CD163和CD31高表達的患者明顯短于CD163和CD31低表達的患者（圖1D）。隨后，我們采用qPCR、免疫組化等方法檢測70例膠質瘤患者中TMEM119、CD163、CD31的表達（圖1E）。皮爾遜相關分析顯示，CD163或TMEM119與CD31或微血管密度（MVD）之間存在很強的正相關關系（圖1F-I）。值得注意的是，CD163和TMEM119高分組的MVD高于低分組（圖1J-L）。Kaplan-Meier生存分析還表明，CD163和CD31表達較高的膠質瘤患者的中位生存時間短于CD163和CD31表達較低的膠質瘤患者（圖1M）。總之，這些結果表明，M2小膠質細胞與GBM患者微血管密度呈正相關。

2）M2小膠質源性外泌體在體外和體內促進血管生成

我們通過qPCR、western blotting和ELISA分析驗證原始HMC3的M2極化，M2標記物（CD163、CD206、ARG1、IL-6和TGF-β）顯著上調，M1標記物（IL1β和TNF-α）下調（圖2A-C）。我們分離純化小膠質細胞來源外泌體（MDE），并通過透射電鏡（TEM）觀察（圖2D）。NTA顯示，室溫下MDE的平均直徑為132 nm（圖2E）。通過western blotting檢測MDE的標記基因（CD9、CD81和TSG101）（圖2F）。此外，PKH26分析表明，HUVEC可以吸收MDEs（圖2G）。我們進一步檢測了M2-MDEs對hBMECs的直接影響。所有EDU、MTS、transwell、遷移和試管形成分析表明，與GW4869治療組和原始MDEs治療的組相比，M2- MDEs治療后hBMECs的生存能力、侵襲、遷移和試管形成能力都有所提高（圖2H-M）。總之，這些結果表明M2-MDEs在體外可以促進血管生成。

為了進一步證實M2-MDEs能夠促進體內血管生成，我們構建了基于C57BL/6小鼠的同源GBM模型。我們將BV-2 M2或幼稚外泌體注射到GBM荷瘤小鼠體內。結果表明，M2-MDEs治療后的腫瘤體積增大（圖2N，O）。Kaplan-Meier生存分析表明，M2-MDEs治療可比原始MDEs減少中位生存時間（圖2P）。免疫組織化學顯示，M2-MDEs治療可以上調Ki67和CD31的表達以及MVD（圖2Q，R）。因此，這些結果表明M2-MDEs在體內可促進GBM的腫瘤發生和血管生成。

3）M2-MDEs將circKIF18A運輸到hBMECs中

在HMC3的na?ve和M2-MDEs之間進行CircRNA測序。結果顯示，有17個差異表達的circRNAs。其中，與幼稚MDEs相比，circKIF18A是M2-MDEs中上調最高的CircRNA（圖3A、B、D）。CircKIF18A是從KIF18A mRNA的轉錄本之一反向拼接而成，由其5-14個外顯子組成。Sanger測序證實了頭-尾剪接（圖3C）。瓊脂糖凝膠電泳顯示，cDNA中的發散引物擴增了circKIF18A，但gDNA沒有擴增（圖3E）。此外，RNase R處理顯示circKIF18A的表達略有變化，而其線性RNAs KIF18A明顯減少（圖3F）。FISH分析顯示，circKIF18A主要位于M2 HCM3和hBMECs的細胞質中（圖3G）。此外，qPCR用于檢測MDEs治療后hBMECs中circKIF18A的表達，結果顯示，M2-MDEs治療后circKIF18A的表達高于幼稚MDEs治療的hBMECs（圖3H）。然后，M2-HMC3中circKIF18A的表達被敲低或過表達，并通過qPCR進行驗證（圖3I）。同樣，在circKIF18A-KD M2-MDEs治療后，qPCR也顯示circKIF18A-KD M2-MDEs（圖3J）和hBMECs（圖3K）中circKIF18A表達下調。然而，circKIF18A-OE M2-MDEs治療后的結果相反（圖3J，K）。總之，這些結果表明circKIF18A在M2-MDEs中過表達，并可通過MDEs轉運到內皮細胞中。MTS、EDU、transwell、遷移和試管形成分析表明，與陰性對照（NC）M2-MDEs相比，circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，hBMECs的細胞活力、增殖、侵襲、遷移、分支數量和小管長度均減少（圖3L-P），提示M2小膠質細胞外泌體circKIF18A在體外可促進血管生成。

4）M2小膠質細胞外泌體circKIF18A可直接與FOXC2結合

由于M2極化與GBM患者微血管密度相關，我們基于CD163在TCGA和CGGA數據庫中的表達進行了GSEA。我們收集了至少在兩條血管生成途徑中起作用的基因，發現了6個重疊基因，包括PTGS2、FLT4、SULF1、FOXC2、NRP1和VEGFA（圖4A，B）。我們進一步探討了circKIF18A與hBMECs中這些基因之間可能的分子機制。qPCR顯示，在hBMECs中，經circKIF18A-KD或circKIF18A- OE M2-MDEs治療后，這六個基因的mRNA表達沒有持續變化（圖4C）。然而，WB顯示，在circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，VEGFA和FOXC2表達下調，而在circKIF18A-OE M2-MDEs處理后，PTGS2、NRP1、FOXC2的蛋白表達上調（圖4D）。因此，FOXC2可能是受circKIF18A調控的候選基因。根據catRAPID數據庫的預測，circKIF18A可以與FOXC2蛋白結合，尤其是circKIF18A的Δ291–350區域與FOXC2蛋白的Δ376–427區域之間的相互作用位點（圖4E）。RIP分析顯示，抗FOXC2組中circKIF18A的相對富集度明顯高于IgG治療組。此外，在circKIF18A-OE M2-MDEs處理后，circKIF18A的富集程度更高，而在circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，circKIF18A的富集程度降低（圖4F）。RNA下拉分析還表明，生物素化的circKIF18A wt探針可以下拉hBMEsC中的FOXC2，而circKIF18A mt探針不能（圖4G）。此外，將FOXC2 DNA片段克隆到pCMV5質粒中并轉染到hBMECs中。RIP分析進一步顯示，在pCMV5-Δ376–427組中，circKIF18A的富集程度更高（圖4H）。這些結果表明，circKIF18A可以直接與FOXC2蛋白結合。MG-132處理hBMECs后，由circKIF18A-KD M2-MDE引起的FOXC2蛋白表達減少得到恢復（圖4I）。CHX分析表明，在hBMECs中，經circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，FOXC2蛋白的半衰期縮短，經circKIF18A-OE M2-MDEs處理后，FOXC2蛋白的半衰期延長（圖4K，L）。此外，在hBMECs中，經circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，FOXC2主要存在于細胞質中，幾乎沒有核分布，而經circKIF18A-OE M2-MDEs處理后，其核分布明顯增加（圖4M）。CircKIF18A-KD M2-MDEs處理下調了細胞核中FOXC2的表達，而CircKIF18A- OE M2-MDEs處理上調了細胞核中FOXC2的表達（圖4J）。因此，這些結果表明M2-HMC3通過外泌體circKIF18A誘導FOXC2穩定性和核易位。

5）M2小膠質細胞外泌體circKIF18A通過FOXC2促進體外血管生成

為了進一步證實M2小膠質細胞外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2促進血管生成，hBMECs中FOXC2的表達被基于慢病毒的RNAi沉默，并且qPCR和WB驗證了這些效應（圖5A，B）。盡管使用circKIF18A-OE M2-MDEs處理，MTS、EDU、transwell、migration和tube formation實驗顯示FOXC2敲除后，與陰性對照組相比，EDU陽性hBMECs的比率、hBMECs的侵襲和遷移數量、hBMECs的分支數量和小管長度均下降（圖5C–G）。因此，這些結果表明，M2小膠質細胞外泌體circKIF18A在體外通過FOXC2促進血管生成。

6）M2小膠質外泌體circKIF18A可促進FOXC2對ITGB3、CXCR4、DLL4和PI3K/AKT信號通路的轉錄調控能力

我們根據Jaspar數據庫的預測進一步進行了熒光素酶報告分析和芯片分析（圖6A-D）。結果表明，在circKIF18A-KD M2-MDEs治療后，pGL3-ITGB3-wt、pGL3-CXCR4-wt和pGL3-DLL4-wt的相對熒光素酶活性均下調，而在circKIF18A-OE M2-MDEs治療后，其相對熒光素酶活性增強（圖6E–J）。芯片分析還表明，在使用circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，抗FOXC2可降低hBMECs中ITGB3、CXCR4和DLL4的富集度（圖6K），而在使用circKIF18A-OE M2-MDEs處理后獲得相反的結果（圖6L）。此外，qPCR和WB也證實了circKIF18A-KD或circKIF18A-OE M2-MDEs處理后ITGB3、CXCR4和DLL4的表達水平（圖6M-P）。據報道，FOXC2可以通過激活PI3K/AKT信號促進腫瘤的惡性表型。用WB檢測PI3K/AKT信號的活性。結果表明，在hBMECs中，經circKIF18A-KD MDEs治療后，p-PI3K、p-AKT和p-MTOR的表達均下調（圖6Q），而經circKIF18A-OE MDEs治療后，結果相反（圖6R）。

7）M2小膠質細胞外泌體circKIF18A促進體內腫瘤生長和血管生成

Mmu_U circ_0009168是小鼠體內circKIF18A的同源circRNA。其在BV-2中的過表達和敲除通過qPCR進行驗證（圖3E）。然后將mmu_circ_0009168-KD或mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs注射到C57BL/6小鼠的同源GBM模型中。結果表明，與NC M2-MDEs相比，mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs治療后腫瘤體積明顯增大（圖7A，B）。Kaplan-Meier生存分析表明，mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs比NC M2-MDEs能縮短中位生存時間（圖7C）。免疫組織化學顯示，mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs治療后，Ki-67、CD31和MVD的表達增加（圖7D，H）。然而，mmu_circ_0009168-KD M2-MDEs治療后的結果相反（圖7D-H）。這些結果表明，M2小膠質細胞外泌體circKIF18A在體內促進腫瘤的生長和血管生成。為了說明我們的發現，圖7I中的示意圖顯示，膠質母細胞瘤相關的小膠質細胞來源的外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2促進血管生成。

結論：M2小膠質細胞通過運輸外泌體circKIF18A進入 hBMECs，促進GBM血管生成。從機制上講，circKIF18A可以結合hBMECs中FOXC2，維持其穩定性和核轉位。FOXC2可以通過轉錄調控ITGB3、CXCR4、DLL4的表達，激活PI3K/AKT信號通路。我們的研究為GBM的抗血管生成治療提供了新的機制和靶點，這可能會改善抗血管生成治療的效果。

參考文獻：

Jiang Y, Zhao J, Xu J, Zhang H, Zhou J, Li H, Zhang G, Xu K, Jing Z. Glioblastoma-associated microglia-derived exosomal circKIF18A promotes angiogenesis by targeting FOXC2. Oncogene. 2022;41(26):3461-3473. doi: 10.1038/s41388-022-02360-4.