肌萎縮性脊髓側索硬化癥（ALS）一種致命疾病，其特征是異常的可變剪接（AS）。運動神經元（MN）中剪接因子TDP-43的核丟失和細胞質積累是ALS疾病晚期的標志。然而，尚不清楚在TDP-43病理發生前是否存在改變的AS。本研究利用散發性和家族性ALS患者的人類誘導多能干細胞來源的運動神經元(MNs)，研究了在ALS早期階段的改變AS及其起源。這項研究強調，ALS中附加的RBP-RNA擾動與TDP-43同時發生。本研究于2022年6月發表在《Acta Neuropathologica》IF：15.887期刊上。

技術路線：

主要研究內容：

1、質譜（MS）鑒定ALS中非可溶性候選RNA結合蛋白（RBP）

TDP-43的不可溶性是ALS的標志。利用來自散發性ALS（sALS）和家族性ALS（fALS）患者的誘導多能干細胞來源的運動神經元（iPSC-MN）建模，作者首先探究了是否有其他的RBP在ALS iPSC-MN中表現出不溶性增加，分離其不可溶性蛋白組分，用于MS分析（Fig. 1a）。總計鑒定到88個蛋白在ALS的不可溶性蛋白組分中富集（Fig. 1b）。當樣本標簽被隨機打亂時，觀察到平均有7.5個蛋白質在相同的統計閾值上差異富集，這表明存在als特異性蛋白質不溶性模式（Fig. 1c）。88個候選蛋白包括細胞骨架成分和運動蛋白，這些功能類別與主要的ALS體外表型相關（Fig. 1d）。這包括一些突出的蛋白，包括KIF5A，和5個RBPs：NOVA1，ELAVL4，FXR2，RBFOX2，RBFOX3（Fig. 1d）。有趣的是，不可溶性TDP-43蛋白在ALS組和對照組間不差異。由于作者主要感興趣的RBP，所以利用WB監測了這5個候選RBP，結果顯示不可溶性NOVA1，NOVA2，ELAVL4， RBFOX2，RBFOX3的表達在ALS組增加（Fig. 1e and f）。而可溶性蛋白NOVA1和NOVA2也增加了。總之，作者在ALS-iPSC-MNs中鑒定到5個豐度增加的非可溶性RBP蛋白。

圖1對iPSC衍生的運動神經元進行蛋白分餾，然后進行質譜分析，發現RBPs在ALS中溶解度增加

2、NOVA1，NOVA2和RBFOX2和ALS中的可變剪切有關

NOVA1，NOVA2，RBFOX2和TDP-43是著名的AS調控因子。為了鑒定它們的RNA結合位點，對每個RBP在兩個對照ALS-iPSC-MNs細胞系（CV-B和 Ctrl-1-2）進行了eCLIP實驗并測序了IP文庫（Fig. 2a）。NOVA蛋白主要結合內含子序列，RBFOX2和TDP-43與內含子序列和3個UTR相互作用（Fig. 2b）。不出意外的，同源體NOVA1和NOVA2共享了大量的結合位點組分，大約93%的NOVA2結合位點也可與NOVA1結合（Fig. 2c上）。有趣的是，RBFOX2中超過10%的位點和TDP-43共享（Fig. 2c上）。在基因轉錄水平上，約60%的TDP-43靶點也是NOVA1的靶點（Fig. 2c下）。K-mer分析為TDP-43（Fig. 2d），NOVA（Fig. 2e and f）和RBFOX2（Fig. 2g）檢索到可重復的、已知的和高度富集的序列motif。因此，iPSC-MNs中對NOVA1、NOVA2、RBFOX2和TDP-43的eCLIP分析明確揭示了它們在基因區域和序列motif水平上已知的結合偏好。

為了將這些RBP的結合位點與AS變化聯系起來，生成了相應的配對端RNA-seq數據集。集中分析在上游外顯子和下游外顯子所包含的pre-mRNA 區域，觀察到相對于Ctrl，NOVA1、NOVA2 和 RBFOX2 結合位點在sALS（Fig. 2h）和 fALS（Fig. 2i）盒式外顯子處的AS顯著富集。與TDP-43相比，這三種蛋白富集的統計學意義一致更高（Fig. 2h and i）。引人注目的是，與本研究的數據集相似，在AnswerALS聯盟的這些數據集中，ALS和Ctrl之間的盒式外顯子AS中，NOVA1、NOVA2和RBFOX2結合位點也在統計上豐富（Fig. 2j and k）。為了驗證這些結果，作者進行了RNA測序和AS分析，并鑒定到277個顯著的AS事件，且在兩個eCLIP重復之一的SPG11-HSP中，RBFOX2結合也在AS中顯著富集（Fig. 2l）。總之，NOVA1、NOVA2和RBFOX2的結合與ALS中差異調控的AS事件密切相關，并且NOVA1和NOVA2在ALS中表現出強烈的富集。

圖2 NOVA1、NOVA2和RBFOX2的結合與ALS中差異調節的AS事件相關

3、NOVA1在ALS iPSC-MNs中增加，而在TDP-43細胞質定位的小鼠和化學壓力的iPSC-MNs中減少

NOVA蛋白是神經元富集的AS因子。NOVA1敲低小鼠是出生后致死的由于進行性運動功能障礙伴脊髓細胞死亡增加。小鼠的表達分析表明，Nova1和Nova2的表達模式是相互的，其中，Nova2主要表達在皮層和海馬，而更高水平的Nova1在中腦和脊髓中觀察到。Nova1與脊髓運動神經元生物學之間的緊密聯系，使作者專注于Nova1在人類MNs中的關聯及其在ALS中的功能改變。

作者觀察到sALS iPSC-MN中NOVA1 mRNA水平顯著升高（Fig. 3a），在fALS樣本中，NOVA1 mRNA水平也明顯升高（Fig. 3b）。在 sALS-AA 數據集中也觀察到 NOVA1 水平的增加（圖 3c），而 C9-ALS-AA 的增加趨勢未達到統計學意義（圖 3d）。這種NOVA1 mRNA在ALS中的增加也反映在蛋白質水平上（Fig. 3e and f）。接下來，探究TDP-43功能，特別是功能喪失或細胞質毒性功能獲得是否與NOVA1 mRNA水平的改變相關。分析了3個常用的TDP-43敲低的RNA-seq數據集，沒有發現NOVA1 mRNA水平的變化（Fig. 3g–i）。然而，在缺乏核定位信號的TDP-43過表達的小鼠模型中，NOVA1 mRNA水平顯著降低（Fig. 3j）。在iPSC-MN中應用化學應激源嘌呤霉素(puromycin)，其可抑制蛋白質翻譯，并促進細胞質TDP-43積累，也可導致NOVA1水平的降低（Fig. 3k）。這些結果表明在ALS iPSC-MN中，NOVA1表達增加，細胞質TDP-43水平升高與NOVA1 mRNA水平降低相關。

圖3在ALS iPSC-MN中，NOVA1表達增加，細胞質TDP-43水平升高與NOVA1 mRNA水平降低相關

4、ALS iPSC來源的運動神經元表現出異常的NOVA1功能

為了理解NOVA1如何影響MN的AS，構建了NOVA1敲低和過表達模型（Fig. 4a-c）。生成RNA-seq數據集后對差異AS事件進行兩兩比較。結果顯示NOVA1過表達導致AS事件增多（n=3046），敲低NOVA1導致AS改變減少（n=174），其中35個AS事件在兩者間共享（Fig. 4d）。正如預期的那樣，在NOVA1過表達（Fig. 4e）和敲低（Fig. 4f）條件下，NOVA1結合位點在不同AS事件中富集。由于NOVA同源蛋白共享結合位點(圖2c)，所以NOVA2的結合位點也在AS位點富集也就不意外了（Fig. 4e and f）。為了了解NOVA1對AS的位置依賴效應，確定了在AS事件周圍特定位置的NOVA1結合位點富集，并包括了AS變化的方向性（Fig. 4g）。雖然在NOVA1過表達時被排除的外顯子在選擇性外顯子中富集了NOVA1結合位點，但獲得NOVA1功能時包含的外顯子在上游和下游內含子中富集了NOVA1結合位點（Fig. 4h）。當NOVA1敲除時AS事件中的NOVA1結合模式發生了相反的變化（Fig. 4i）。這些數據表明，NOVA1與選擇性外顯子結合促進其排除，與下游內含子結合提高外顯子包含水平。相反，與上游內含子結合可能會對備選外顯子產生距離依賴的影響，近端與遠端結合分別介導排斥或包含（Fig. 4j）。

圖4在人類iPSC運動神經元中，NOVA1以位置依賴的方式介導AS

為確定NOVA1在ALS中的確切作用模式，采用無監督k-means聚類，使用 7,282 個 AS 事件的包含水平差異顯著改變了 4 個 ALS 數據集中至少一個數據集的AS事件。應用了兩個NOVA1數據集和互補的SPG11-HSP數據集。此外，整合了從NOVA1的位置依賴AS分析中獲得的信息（Fig. 5a）。總共獲得了8個集群(0-7)分組AS事件，它們在4次ALS比較中至少有一次發生變化（Fig. 5b）。其中，簇0在所有4個ALS數據集和NOVA1敲除條件下顯示外顯子不存在，但在NOVA1過表達iPSC-MN中包含（Fig. 5c）。SPG11-HSP患者在cluster 0 AS事件中沒有表現出改變（Fig. 5c）。整合本研究的 eCLIP-seq 數據后，檢測到簇 1、2、3、4 和 5 中 NOVA1 結合富集的顯著性較低（Fig. 5d and e）。 簇 7 表現出與替代外顯子的強結合（Fig. 5d and e，棕色條），但改變 NOVA1 水平后的變化是中等的，表明這些事件可能受 NOVA1 影響，但不能僅通過改變 NOVA1 水平來改變。簇 6 的變化伴隨著 NOVA1 與上游內含子結合的強烈富集（Fig. 5d and e，黃色條），表明該簇受 NOVA1 的影響，受混合的、患者特異性的方向性模式影響。有趣的是，簇0顯示出NOVA1與上游內含子的強結合（Fig. 5d and e，粉紅色條，箭頭）。結合觀察到的AS的變化(圖5c)，聚類0代表ALS特異性的NOVA1功能缺失特征。

圖5 ALS中異常的NOVA1狀態表現出功能獲得和功能喪失的特征

5、在ALS死后組織MN中，NOVA1的表達隨疾病狀態而動態變化

iPSC衍生模型代表了疾病的早期階段。為了研究ALS早期階段NOVA1細胞表達模式的組織病理學改變，對死后脊髓切片進行了神經病理學分析。對9例sALS和7例Ctrls脊髓MN的TDP-43病理進行了分類然后檢測NOVA1的表達模式（Fig. 6a）。sALS中TDP-43核丟失的MNs數量各不相同。Ctrl MNs未觀察到TDP-43的核丟失。有趣的是，絕大多數具有TDP-43核保留的sALS MNs并沒有表現出細胞質TDP-43的積累。因此，在進一步的分析中只考慮TDP-43的核存在（Fig. 6b，紫色箭頭）和核丟失（Fig. 6b，紅色箭頭）作為將sALS MNs分為兩類的指標。隨著核TDP-43的丟失，MNs的核NOVA1水平顯著降低（Fig. 6c）。核TDP-43存在的MNs細胞質NOVA1明顯增加（Fig. 6d）。為了研究這些變化與生理表達模式的比較，還分析了Ctrl樣本中的MNs（Fig. 6e）。關于NOVA1的表達，核保留TDP-43的sALS MNs顯示NOVA1核正常表達，而TDP-43核丟失的細胞表現出細胞質NOVA1信號顯著增加（Fig. 6f）。觀察到具有低 STMN2 表達的運動皮層樣本中 NOVA1 表達顯著降低（Fig. 6i），并且在來自 sALS 的激光捕獲的 MN 數據集中有類似的趨勢（Fig. 6h），與此前的觀察結果一致即NOVA1 水平在 TDP-43表達缺乏其核定位信號時和化學應激源的應用時顯著降低（Fig. 3j and k）。

圖6 ALS和Ctrl患者腰脊髓死后MN中NOVA1的表達

總之，本研究使用質譜鑒定到88個候選蛋白在ALS 患者衍生的 iPSC-MN 不溶性組分中富集，包括RBPs：NOVA1、NOVA2、ELAVL4、RBFOX2 和 RBFOX3。使用 eCLIP 分析，確定了 NOVA1、NOVA2 和 RBFOX2 在 ALS 中可變剪接的盒式外顯子處的富集結合。相反，在非 ALS 運動神經元疾病隊列中，NOVA 蛋白在 AS 位點的富集程度較低。整合 NOVA1 過表達和敲除的RNA-seq數據集，發現NOVA1 的 AS功能在 ALS 中被破壞，包括 NOVA1 功能特征的持續丟失。在細胞水平上，檢測到ALS 中蛋白質的表達增加。在 ALS 患者的死后脊髓組織中，NOVA1 的表達模式是階段依賴性的，在尚未表現出 TDP-43 病理學的 MNs中已經存在升高的細胞質 NOVA1 水平。NOVA1 改變的細胞和功能特性是 ALS 的分子發病機制的特征，先于該疾病的神經病理學特征（Fig. 7）。

圖7 通過TDP-43病理學確定ALS病程早期和晚期的NOVA1病理改變和功能異常的模式圖。NOVA1細胞和功能特性的改變在ALS早期特別存在。

參考文獻：

Krach Florian., Wheeler Emily C., Regensburger Martin., Boerstler Tom., Wend Holger., Vu Anthony Q., Wang Ruth., Reischl Stephanie., Boldt Karsten., Batra Ranjan., Aigner Stefan., Ravits John., Winkler Juergen., Yeo Gene W., Winner Beate.(2022). Aberrant NOVA1 function disrupts alternative splicing in early stages of amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol, undefined (undefined), undefined. doi:10.1007/s00401-022-02450-3