環狀RNA (CircRNAs)在不同疾病中發揮著重要作用。外泌體是細胞間通訊的重要中間體。雖然兩者在癌癥中都有廣泛報道，但外泌體來源的環狀RNA很少被研究。本研究中，作者通過高通量測序確定了膀胱癌(BCa)組織和外泌體中不同表達的環狀RNA對BCa的影響。本文于2022年3月發表于《Molecular Therapy》，IF= 8.986。

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1 CircTRPS1在BCa腫瘤和外泌體中作為預后相關的上調CircRNA

作者從4個BCa組織中提取總RNA，并將其與正常組織配對，以識別在BCa中具有重要生物學功能的環狀RNA (Fig 1A)。其中CircTRPS1 (hsa_ Circ_0085361)是所有差異表達CircRNA中差異表達最顯著的(Fig. 1B)。CircTRPS1的基因組定位為chr 8 nc_000008.11: 115382382 -115，695，751，來源于TRPS1基因(Fig 1C)。放線菌素D處理表明TRPS1的環狀RNA形式比線性形式更穩定(Fig 1D)。核糖核酸酶R降低了BCa細胞系中線性TRPS1 mRNA的水平，而對CircTRPS1的水平沒有影響，進一步證實了CircTRPS1結構(Fig 1E)。此外，CircTRPS1主要位于細胞質中(Fig 1F)。Kaplan-Meier圖顯示高表達的CircTRPS1與較低的總生存率相關(Fig 1G)。有趣的是，CircTRPS1 在BCa腫瘤組織的積累不僅限制在細胞質中，而且在一些細胞膜和細胞間隙觀察到CircTRPS1信號，這表明CircTRPS1在BCa微環境中聚集在外泌體中發揮生物功能(Fig 1H)。此外還發現CircTRPS1在尿源性外泌體中的表達與BCa的臨床分期呈正相關(Fig 1I-K)。

Fig1 CircTRPS1在BCa腫瘤和外泌體中作為預后相關的CircRNA上調

2、外泌體來源的CircTRPS1在體外促進BCa細胞的增殖和侵襲

與泌尿上皮細胞系(SV-HUC-1)比較，CircTRPS1在5種膀胱癌轉移的細胞癌細胞系(RT4、UM-UC-3、T24、5637、J82)中高表達(Fig 2A）。CCK-8實驗證實CircTRPS1敲低顯著抑制BCa細胞的增殖(Fig 2B，C），5-EdU測定得到相似結果(Fig. 2D)。作者進一步分析發現CircTRPS1敲低后，細胞凋亡率顯著增加，這表明si-CircTRPS1對細胞凋亡有輕微的抑制作用(Fig. 2E)。與SV-HUC-1細胞相比，BCa細胞來源的外顯子中CircTRPS1表達更高(Fig 2F)。電子顯微鏡分析發現通過表達外泌體標志物TSG101、CD63和CD81(Fig 2H）。此外，作者用PKH67標記BCa細胞來源的外泌體，并將外泌體與癌細胞孵育。在BCa細胞中觀察到幾個密集的PKH67，表明外泌體被內吞到BCa細胞中 (Fig 2I)。si- CircTRPS1轉染的T24和來自外泌體的UMUC-3細胞減少了增殖和侵襲(Fig 2J，K)。

Fig2 外泌體來源的CircTRPCircTRPS1作為miR-141-3p的海綿在體外促進BCa細胞的增殖和侵襲

3. CircTRPS1作為miR-141-3p的海綿

AGO2 RIP測定T24細胞顯示內源性的CircTRPS1被富集(Fig 3A)，這表明miRNA可能與CircTRPS1結合。作者進行了miRNA測序，發現CircTRPS1敲除后差異表達的miRNA。通過生信分析篩選出miR-23b-3p、miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-125a-5p和miR-125b-5p是與CircTRPS1相關的潛在miRNAs，在H1299細胞中使用CircHMGB2探針進行CircRIP，通過qRT-PCR觀察miR-181a-5p的顯著富集(Fig 3a)。通過RIP進一步驗證CircHMGB2和miR-181a-5p之間的相互作用，發現抗AGO2抗體顯著富集了CircHMGB2和miR-181a-5p (Fig 3B)，而這些miRNA均與BCa預后相關。通過AGO2 RIP對富集的miRNA進行qRT-PCR，發現miR-141-3p和miR-200a-3p是AGO2-CircTRPS1復合物中最豐富的miRNA(Fig. 3C)。同樣的，miR-141-3p和miR-200a-3p在CircTRPS1敲低BCa細胞中上調(Fig. 3D)。RNA下拉實驗證實CircTRPS1與miR-141-3p的相互作用大于miR-200a-3p(Fig 3E)。作者只檢索到了CircTRPS1與miR-141-3p和miR-200a-3P均有1個預測的結合位點。為了進一步驗證miR-141-3p和miR-200a-3p與CircTRPS1的直接結合相互作用，作者生成了具有預測miRNA結合位點的CircTRPS1片段，并將其插入到雙熒光素酶報告質粒中(Fig 3F)。miRNA模擬物導致相對熒光素活性顯著降低，但在CircRNA突變組中只發現了可以忽略的熒光素活性變化(Fig 3G)。此外，FISH實驗證實CircTRPS1在細胞質中與miR-141-3p共定位，表明CircTRPS1直接結合 miR-141-3p(Fig 3H)。此外，miR -141- 3p的相對表達與CircTRPS1呈負相關(Fig 3I)。接下來轉染了陰性對照(NC)或CircTRPS1敲低的miR-141-3p 模擬物/抑制劑T24細胞。CCK8(Fig 3J)和Transwell實驗(Fig 3K)顯示miR-141-3p抑制劑促進了BCa細胞的增殖和侵襲表型，而si-CircTRPS1消除了BCa細胞的這一生物學過程。綜上所述，作者的結果表明CircTRPS1作為miR-141-3p的海綿。

Fig3 CircTRPS1作為miR-141-3p的海綿

4. CircTRPS1通過調節GLS1的表達改變谷氨酰胺代謝，導致BCa氧化還原平衡失調

考慮到CircTRPS1敲除后顯著的表型改變，作者使用代謝組學進一步研究sh-CircTRPS1 T24細胞的代謝功能障礙(Fig 4A)。在sh-CircTRPS1 T24細胞中，參與TCA循環的L-谷氨酸、GSH和幾種代謝物下調(Fig 4A)。GSH代謝、糖異生、谷氨酸代謝和脂肪酸氧化是主要富集的代謝途徑，這表明BCa細胞存在能量饑餓和氧化還原穩態失調(Fig 4B)。這些代謝途徑都是谷氨酰胺代謝的下游。接下來從T24和T24 sh-CircTRPS1細胞的RNA-seq中觀察CircTRPS1相關代謝功能障礙相關的關鍵酶(Fig 4C)。發現當抑制GLS1在癌細胞中的表達，細胞內谷氨酸水平顯著降低，伴隨著GSH和ɑ-KG降低，導致TCA循環成分減少，糖異生增加(Fig 4D)。同時發現miR-141-3p和GLS1的表達呈負相關 (Fig 4E)。雙熒光素酶實驗表明GLS1 mRNA與miR-141-3p直接結合(Fig4F)。TCGA中BCa患者的基因集富集分析顯示，GLS1差異表達引起的能量饑餓主要影響mTOR通路(Fig 4G)。谷胱甘肽缺乏會提高細胞內ROS水平，從而降低細胞活力，類似于能量饑餓。接下來發現si-CircTRPS1 T24細胞中ROS水平顯著升高，與GSH水平下降相關(Fig 4H)。有趣的是，之前關于miR-141-3p的研究表明，ROS平衡與其生物學功能相關。mir - 1413p抑制劑和GLS1過表達可以挽救CircTRPS1敲除引起的mTOR和上皮-間質轉化(EMT)通路的抑制作用以及細胞內ROS水平的降低(Fig 4H)，恢復氧化還原平衡(Fig 4I)。

Fig 4 CircTRPS1通過調節GLS1的表達改變谷氨酰胺代謝，導致BCa氧化還原平衡失調進入翻譯頁面

5. 外泌體來源的CircTRPS1誘導BCa TMEs中的T細胞衰竭

CD8+ T細胞是多種免疫調節軸的最終執行者，也是主要的預后相關免疫細胞類型之一。作者進一步發現CircTRPS1在與BCa細胞的外泌體中是否對CD8 + T細胞發揮作用。于是根據CD8和CircTRPS1的相對表達水對90名患者分為四組(Fig 5A)。有趣的是，雖然高CD8+ T細胞浸潤表明BCa預后較好(Fig 5B)，但CD8+高表達CircTRPS1地表達組預后最好，而CD8+低表達CircTRPS1高表達組預后最差(Fig 5C)。作者發現當用Exo-si-CircTRPS1或BPTES處理時，CD8+ T細胞中干擾素IFN-g(Fig 5D)、顆粒酶 B (GZMB)(Fig 5E)和穿孔素(Fig 5F)的表達上調。同時，研究發現，在Exo-si-CircTRPS1或BPTES處理下，CD8+ T細胞表達的PD-1減少(Fig 5G)，在BPTES處理下Tim-3的表達減少(Fig 5H)。此外，與Exo-si-CircTRPS1和BPTES結合， CD8+ T細胞表現出強大的抗腫瘤細胞毒性(Fig 5I)。

Fig5外泌體來源的CircTRPS1在BCa腫瘤微環境中誘導T細胞衰竭

6、 沉默外泌體來源的CircTRPS1通過GLS1調控抑制了BCa在體內的生長和轉移

為了進一步探索外泌體來源的CircTRPS1在體內的作用，建立了T24細胞形成的腫瘤，每3天靜脈注射20mg外泌體BPTES（Fig. 6A）。發現BPTES單獨抑制T24細胞在體內的惡性表型。外泌體si-CircTRPS1顯著降低腫瘤生長速度(Fig. 6B)。與之前的體外實驗結果一致，免疫組化(IHC)肛門溶解顯示mTOR通路標記物(GLS1)，ROS調控標記物(Nrf2)， EMT標記物(vimentin和N-cadherin)，細胞凋亡標記物(Bcl-2)和細胞增殖標記物(Ki-67)的表達在si-CircTRPS1外泌體處理后被抑制，在BPTES處理后進一步降低(Fig. 6C)。HE染色顯示，經xosome-si- CircTRPS1處理的T24細胞在肺內形成的結節較少，BPTES進一步抑制了T24細胞的轉移能力(Fig. 6D，E)，與生物發光成像一致(Fig. 6F，G)。總之，CircTRPS1相關的谷氨酰胺代謝重編程在BCa TME中的系統調節作用被提出(Fig. 6H)。

Fig 6 沉默外泌體來源的CircTRPS1可通過GLS1調控在體內抑制BCa的生長和轉移

綜上所述，作者的研究通過CircTRPS1/miR-141-3p/GLS1軸證實了CircTRPS1作為腫瘤啟動子的作用。外泌體來源的CircTRPS1可以海綿化miR-141-3p，增強谷氨酰胺代謝中的關鍵酶GLS1的功能。過表達GLS1可同時增強BCa細胞的增殖能力和侵襲能力，削弱BCa微環境的抗腫瘤免疫功能。因此，作者的研究為BCa提供了新的生物標志物和治療靶點。

參考文獻：

Yang, C., et al., Exosome-derived circTRPS1 promotes malignant phenotype and CD8+ T cell exhaustion in bladder cancer microenvironments. Mol Ther, 2022. 30(3): p. 1054-1070.