m6A是一種新興的mRNA修飾調節因子，在腫瘤發生中發揮著新的作用。盡管m6A修飾在病理和生理過程中都具有重要的功能意義，但其在胰腺導管癌（PDAC）中的作用仍不明確。在這里，我們發現FTO表達與PDAC患者的不良預后相關，并且抑制FTO表達抑制細胞增殖。此外，FTO直接靶向PDGFC，并以m6A-YTHDF2依賴的方式穩定其mRNA表達。PDGFC上調導致Akt信號通路重新激活，促進細胞生長。總之，我們的研究表明，FTO下調導致PDGFC 3?UTR中m6A修飾增加，然后以m6A-YTHDF2依賴性方式調節其轉錄水平的降解，突出了PDAC治療和預后預測的潛在治療靶點。本文于2022年4月發表于“Oncogene”（IF=9.867）上。

技術路線

結果

1）FTO在PDAC中高表達，與不良預后相關

為了解釋m6A在PDAC中的關鍵作用，我們通過m6A比色分析檢測了10例新鮮人胰腺腫瘤組織及其相應正常組織中m6A的整體水平。初步觀察發現，與相應的正常組織相比，PDAC組織中整體m6A豐度顯著降低（圖1A）。然后，為了評估PDAC中主要m6A修飾酶的表達譜，我們分析了TCGA、GTEx、GSE15471和GSE62452的臨床數據集，發現PDAC組織中FTO mRNA表達水平顯著高于正常組織（圖1B）。此外，我們驗證了復旦大學上海癌癥中心（FUSCC）隊列中的生物信息學數據。對含有209名患者樣本的組織微陣列（TMA）進行免疫組織化學（IHC）染色（圖1C）。根據IHC評分，與正常組織相比，FTO在腫瘤組織中的表達水平更高（圖1D）。Kaplan–Meier生存曲線顯示，FTO高表達與PDAC患者預后不良相關（圖1E）。最后，我們發現，與人胰腺導管上皮（HPDE）細胞相比，多個PDAC細胞系中FTO蛋白表達上調（圖1F）。

2）沉默FTO抑制PDAC腫瘤生長

為了研究FTO在PDAC中的作用，用shFTO-a和shFTO-B轉染PANC-1和MiaPaCa-2細胞。FTO敲除效應在mRNA和蛋白質表達水平均得到驗證（圖2A，B）。FTO敲除導致m6A水平增加（圖2C）。FTO敲除顯著降低PDAC細胞增殖（圖2D），并降低集落形成效率（圖2E）。同樣，EdU染色分析表明，FTO敲除大大降低了EdU陽性細胞的百分比（圖2F）。接下來，我們植入了一個皮下胰腺異種移植瘤，以進一步確定FTO在體內的致癌作用。將具有穩定FTO敲除（shFTO-B）的MiaPaCa-2細胞皮下注射到4周齡雌性BALB/c裸鼠體內（圖3A）。與體外觀察結果一致，FTO沉默組的腫瘤生長大小和重量明顯低于對照組（圖3B，C）。隨后使用抗FTO抗體和增殖標記物Ki-67進行IHC染色，結果表明FTO敲除顯著降低了shFTO組的Ki-67染色（圖3D，E）。因此，FTO在促進PDAC腫瘤生長中起著關鍵作用。

3）通過m6A-Seq識別FTO下游靶點

為了確定PDAC中的FTO下游靶點，我們進行了甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）。主成分分析(PCA)顯示，每個樣本有3個重復聚類在一起，表明兩組之間重現性良好(圖4A)。在對照和FTO敲除細胞中，GGAC基序在m6A中高度富集(圖4B)。根據m6A-seq的結果，我們進一步發現m6A峰主要富集在相鄰的編碼序列(CDS)和3’UTR(圖4C)。我們進一步研究了MeRIP-seq表達數據，并探索了m6A和RNA水平均發生顯著變化的峰值比例。事實上，在兩組中檢測到292個具有高甲基化m6A峰值以及mRNA表達降低的基因（圖4D）。在這些差異表達基因（DEG）中，電壓門控離子通道活性、信號轉導和質膜是GO富集分析中最豐富的條目（圖4E）。KEGG富集分析表明，PDAC中PI3K/Akt通路與FTO依賴轉錄相關（圖4F）。為了驗證這一發現，我們檢測了Akt、P-Akt和P-GSK3β的表達（圖4G）。FTO敲除顯著降低了PANC-1和MiaPaCa-2細胞中這些基因的磷酸化水平。在MiaPaCa-2和PANC-1細胞中，scramble和FTO基因敲除組的PDGFC表達差異最大。最重要和有趣的是，在FTO敲低組中，一些下調的轉錄本表現出高甲基化的m6A修飾，包括PDGFC。我們關注PDGFC m6A峰，并發現其mRNA的3?UTR周圍的富集在FTO敲除后增加（圖4H）。因此，PDGFC被選為FTO介導的m6A 修飾的候選靶點。

4）FTO缺失以m6A-YTHDF2依賴的方式下調PDGFC mRNA水平

MiaPaCa-2和PANC-1細胞中的FTO敲除降低了PDGFC mRNA和蛋白質水平（圖5A，B）。通過qRT-PCR（圖5C），在異種移植物中也證實了類似的趨勢。此外，與IgG RIP組相比，FTO敲除顯著促進PDGFC mRNA中的m6A水平（圖5D）。與對照細胞相比，FTO敲除細胞的熒光素酶活性顯著降低。PDGFC-MUT2幾乎消除了這種誘導，表明PDGFC表達的調節受FTO相關m6A修飾的控制（圖5F）。由于YTHDF2作為主要m6A讀取器的特異性，我們假設YTHDF2在PDGFC中的RNA識別和相互作用水平發揮作用。通過評估TCGA和GEO數據庫，我們發現與正常組織相比，PDAC組織中的YTHDF2上調。事實上，通過RNA免疫沉淀（RIP）分析評估，YTHDF2與PDGFC有強烈的相互作用。當FTO被敲除時，PDGFC轉錄本中的YTHDF2富集顯著減少（圖5G）。此外，我們在FTO減少的MiaPaCa-2細胞中敲除了YTHDF2，并觀察到胰腺細胞中PDGFC表達的部分恢復（圖5H，I）。在FTO敲除條件下，YTHDF2敲除也消除了PDGFC mRNA減少的穩定性（圖5J）。因此，我們的數據表明FTO以m6A-YTHDF2依賴的方式調節甲基化PDGFC mRNA水平。

5）PDGFC是一種促癌因子，與PDAC患者的FTO表達呈正相關

TCGA數據分析表明，PDGFC水平與PDAC患者的OS呈負相關，PDGFC和FTO水平之間呈顯著正相關（圖6A，B）。值得注意的是，較高的PDGFC水平與較差的OS顯著相關(圖6C)，并與FTO表達呈正相關(圖6D)。此外，利用在TMAs上進行的IHC染色，我們進一步對PDGFC進行存活分析，并驗證其在腫瘤和相鄰正常組織之間的表達差異（圖6F，H）。此外，如圖6G所示，我們還生成了一個包含PDGFC和FTO的新IHC面板來預測PDAC的預后。Kaplan–Meier生存分析表明，兩種標記物高表達的患者OS最短。

6）FTO介導的PDGFC激活與PDAC的腫瘤發生有關

為了確定PDGFC是否介導FTO在PDAC生長和進展中的作用，我們首先基于PDGFC的內源性表達將編碼人PDGFC插入物的慢病毒載體轉染到細胞中。我們發現PDGFC的過表達特別增加了PDAC細胞活力和集落形成，但也消除了FTO敲除條件下的下降（圖7A-C）。接著，我們評估了胰腺癌細胞中Akt/GSK3β磷酸化、c-Myc和Cyclin D1的表達。FTO敲除降低了這些基因的表達，而PDGFC過表達挽救了這種趨勢（圖7D）。此外，為了進一步證實我們的假設，我們檢測了Akt抑制劑（MK2206）是否可以消除PDGFC過表達細胞中這些基因的表達。在PDGFC過表達的細胞中，Akt/GSK3β磷酸化水平以及c-Myc和Cyclin D1表達上調，而在MK2206處理的細胞中，這些水平降低（圖7E）。

7）FTO誘導PDGFC自分泌活性并與PDAC細胞增殖相關

我們在FTO穩定的敲除細胞中過表達PDGFC，并使用ELISA檢測PDAC細胞分泌PDGFC的內源性水平（圖8A）。正如預期的那樣，穩定敲除FTO后PDAC細胞釋放的PDGFC減少，過表達后PDGFC恢復。FB23-2是一種直接與FTO結合并選擇性抑制FTO m6A去甲基酶活性的抑制劑，它確實抑制PDAC細胞中PDGFC的分泌（圖8B）。CCK-8分析表明，CFPAC-1和MiaPaCa2細胞中FTO的過表達增強了細胞的增殖和活力，而FTO的過表達與PDGFR抑制劑的結合顯示出更強的抑制作用（圖8C，D）。此外，對在DMEM（全培養基）中培養的FTO scramble和敲除細胞進行CCK8分析，無論是否用重組人PDGFC（10 ng /ml）處理，也證明了外源性PDGFC的刺激增殖活性（圖8E）。為了進一步闡明PDGFC誘導的信號通路，我們用重組人PDGFC（10 ng/ml）處理MiaPaCa-2細胞。值得注意的是，48小時的重組人PDGFC預處理可在scramble和FTO敲除條件下誘導Akt/GSK3β激活的磷酸化水平（圖8F）。總之，這些結果表明，自分泌內源性和外源性重組人PDGFC可促進PDAC細胞的生長，其部分由Akt/GSK3β信號驅動。

結論：我們的研究揭示了胰腺癌中m6A甲基化水平的降低是由FTO的失調引起的。FTO和PDGFC的聯合可作為預后工具和治療反應標志物。FTO/PDGFC/PDGFR治療靶點的潛力可用于開發有效治療PDAC的治療方案。這些發現為m6A修飾調控PDAC腫瘤發生的分子機制提供了新的見解。

參考文獻：

Tan Z, Shi S, Xu J, Liu X, Lei Y, Zhang B, Hua J, Meng Q, Wang W, Yu X, Liang C. RNA N6-methyladenosine demethylase FTO promotes pancreatic cancer progression by inducing the autocrine activity of PDGFC in an m6A-YTHDF2-dependent manner. Oncogene. 2022 May;41(20):2860-2872. doi: 10.1038/s41388-022-02306-w.