富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子3 （SRSF3）調控超過90%的蛋白質編碼基因的mRNA選擇性剪接，為生物多樣性提供了必要的來源。目前，有研究建立了SRSF3、m6A修飾、lncRNA剪接與胰腺癌DNA 同源重組修復（HR）之間的聯系，表明異常的選擇性剪接和m6A修飾與胰腺癌化療耐藥密切相關。

技術路線：

主要研究結果

1. 胰腺癌組織中SRSF3表達上調與耐藥有關

首先培養胰腺癌Pan1和BXPC3細胞系，通過重復吉西他濱誘導產生耐藥亞群。與相應的親本系相比，吉西他濱在耐藥亞群中的半最大抑制濃度（IC50）值顯著更高（圖1A和圖1B）。在相同吉西他濱濃度下，這些耐藥細胞的增殖速度明顯快于親本細胞，表明成功構建了Panc1-GR-和BXPC3-GR-耐藥菌株（圖1C和1D）。然后，使用RNA測序（RNA-seq）分析對耐藥和敏感細胞株之間的基因表達譜，以及26名預后較好或較差的晚期胰腺癌患者之間的基因表達譜（圖1E）。SRSF3被鑒定為唯一過表達的剪接基因（圖1F-1H）。

免疫組化數據顯示，SRSF3表達在癌組織中顯著上調（圖1I和1J），這與腫瘤分級的增加相關（圖1K）。在相同的化療條件下，SRSF3高表達腫瘤患者的總生存期和無進展生存期明顯短于srsf3低表達腫瘤患者（圖1L）。qPCR和western blot數據進一步證實了SRSF3在胰腺癌及相應正常組織中的表達數據（圖1M-1O）。因此，SRSF3高表達腫瘤患者接受化療后預后較差，SRSF3的表達與胰腺癌的化療耐藥密切相關。

圖1 SRSF3在人胰腺癌中的表達及預后價值

2. SRSF3與胰腺癌細胞吉西他濱耐藥相關

接下來評估SRSF3在吉西他濱耐藥和敏感胰腺癌細胞系中的表達，發現SRSF3蛋白在耐藥胰腺癌細胞中的表達更高（圖2A）。構建四組穩定的細胞系Panc1-Ctrl與Panc1-SRSF3、Panc1-GR-sh載體與Panc1-GRshSRSF3、BXPC3-Ctrl與BXPC3-SRSF3、BXPC3-GRsh載體與BXPC3-GR-shSRSF3，以評估SRSF3在介導耐藥性中的作用。western blot數據證實成功產生了不同的表達SRSF3的胰腺癌細胞穩定亞系（圖2B和2C）。隨后，平板克隆形成和細胞活力測定數據發現在這些胰腺癌細胞穩定系中，SRSF3的表達確實與吉西他濱耐藥相關（圖2D-2F）。SRSF3的表達被證實可以提高胰腺癌細胞株對吉西他濱的IC50值（圖2E）。

構建SRSF3高低表達的PDX模型，用western blot分析篩選SRSF3高、低表達的組織進行后續移植。裸鼠PDX模型和腹腔腫瘤細胞注射模型數據顯示，SRSF3高表達增強了腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥性，而SRSF3低表達則有相反的效果（圖2G-2N）?？傊?，SRSF3在胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性中起著重要作用。

圖2 SRSF3增強人胰腺癌細胞體內外吉西他濱耐藥

3. SRSF3對lncRNA ANRIL剪接和外顯子包含的調控

為了探究SRSF3的下游分子事件，不同水平的SRSF3表達的胰腺癌細胞進行吉西他濱干預，以確定相關蛋白的表達變化。在吉西他濱處理的細胞中，SRSF3降低了γH2AX、p53、caspase-3和bcl-2的表達，而SRSF3過表達降低了吉西他濱引起的細胞損傷（圖3A）。另外，SRSF3的功能在DNA修復調控中富集（圖3B）。結合圖1G的結果來識別SRSF3的共同差異表達基因以及下游因子：ANRIL是該交叉點唯一與DNA修復相關的基因（圖3C）。利用Ensembl數據庫，根據ANRIL的不同轉錄本設計了引物（圖3D顯示了一些轉錄本圖），并評估了ANRIL在Panc1、Panc1-GR、BXPC3和BXPC3-GR中的表達。發現吉西他濱耐藥腫瘤細胞主要表達兩種轉錄本:ANRIL 208（簡稱ANRIL- l）和ANRIL 223（簡稱ANRIL- s）（圖3E）。根據ENCORI和RNAct數據庫預測，SR家族蛋白SRSF1、3、7和10具有ANRIL的結合位點（圖3F）。因此，進一步檢測了它們在抗性細胞（GR）和親本細胞（野生型[WT]）中的表達。結果顯示，GR細胞中SRSF3表達較高，SRSF10表達較低（圖3G）。RNA免疫沉淀試驗確認了SRSF3和SRSF10對ANRIL的結合能力（圖3H、3I）。RNA下拉試驗發現SRSF3和SRSF10能夠與ANRIL結合（圖3J-3L）。通過構建內生ANRIL pre-mRNA與潛在SRSF3-binding站點，執行一個CLIP-qPCR試驗使用Panc-1-GR細胞（圖3M），發現構建攜帶外顯子1和2的碎片ANRIL能夠綁定到SRSF3蛋白質，而片段包含外顯子2和6綁定到SRSF10（圖3N）。的RNA免疫沉淀實驗數據顯示，敲低SRSF10，SRSF3和ANRIL的結合增加（圖3O），而在敲低SRSF3后，SRSF10和ANRIL的結合也增加（圖3P和S3K）。這表明SRSF3和SRSF10競爭性結合ANRIL可調控ANRIL的剪接。SRSF3 和SRSF10 或在穩定的腫瘤細胞亞系中顯示 SRSF3能夠上調 ANRIL-L 表達但下調ANRIL-S 表達，而 SRSF10 具有相反的效果（圖 3Q 和 3R）。這些數據表明 SRSF3 和SRSF10 與 ANRIL 競爭性結合以調節 ANRIL 剪接（圖 3S）。

圖3 SRSF3誘導ANRIL剪接

4. ANRIL剪接分子的m6A修飾

通過對Panc1-WT與Panc1- GR以及Bxpc3-WT與BXPC3-GR的RNA-seq結果進行GO分析，發現這些基因有m6A修飾（圖4A）。與親本株相比，Panc1-GR和BXPC3-GR中m6A的總體水平升高（圖4B），這表明修改后的m6A水平可能與吉西他濱耐藥有關。利用m6Avar和SRAMP數據庫預測了ANRIL中m6A的修飾位點（圖4C），并針對ANRIL外顯子1上的m6A位點設計了一套序列特異性的morpholino反義寡核苷酸（MAOS）（圖4D）。使用m6A特異性免疫沉淀試驗評估了Panc1-GR/BXPC3-GR與其親本系之間ANRIL m6A水平的差異（圖4E）。此外，還發現SRSF3表達與ANRIL中的m6A修飾相關（圖4F、4G），而METTL3和MAOS-ANRIL的過度表達也顯示了ANRIL中m6A修飾的調控（圖4H、4I）。將MAOS-ANRIL轉移到具有穩定敲除SRSF3的Panc1-GR細胞系中，發現ANRIL中的m6A修飾水平降低，而在SRSF3敲除后過度表達MAOS-ANRIL的Panc1-GR細胞中的m6A修飾水平低于對照細胞（圖4J、4K）。這些結果表明，SRSF3和METTL3是ANRIL中m6A修飾的重要調節因子，這在Panc1-WT細胞中得到了進一步證實（圖4L、4M）。這些結果支持了在ANRIL中SRSF3和m6A修飾之間外顯子1上m6A位點的重要性。ANRIL中m6A修飾的水平對于SRSF3與ANRIL-L結合至關重要（圖4N、4O），并且與ANRIL剪接事件的發生密切相關（圖4P-4S）。總之， ANRIL和SRSF3表達中m6A修飾水平在ANRIL- l亞型的產生中同樣重要。

圖4 ANRIL的剪接受m6A RNA甲基化的調控

5. lncRNA ANRIL亞型對吉西他濱耐藥的不同影響

與親本細胞相比，Panc1-GR和BXPC3-GR細胞中ANRIL-L表達更高，ANRIL-S表達更低（圖5A）。熒光原位雜交（FISH）實驗顯示，ANRIL-L在Panc1-GR和BXPC3-GR細胞核中的表達高于Panc1-WT和BXPC3-WT（圖5B），而ANRIL-S在細胞核中的表達高于Panc1-WT和BXPC3-WT。使用Panc1-WT和Panc1-GR生成了穩定的ANRIL-L過表達和ANRIL-S敲除細胞系，并使用qPCR驗證有效轉染（圖5C）。ANRIL-L誘導胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥，而ANRIL-S對耐藥無顯著影響（圖5D-5I）。ANRIL-L也影響腫瘤細胞的DNA損傷修復。結果表明，ANRIL-L能夠下調DNA損傷因子gH2AX的表達，而彗星實驗證實ANRIL-L與DNA修復能力密切相關（圖5J、5K）。體內裸鼠實驗進一步確認了該體外數據（圖5L-5O）。這些結果總體上證實了ANRIL-l，而不是ANRIL-S，具有調節胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥和增強DNA修復能力的能力，表明不同的ANRIL亞型在胰腺癌細胞中具有不同的功能。

圖5 lncRNA ANRIL-L亞型對吉西他濱耐藥的影響

6. SRSF3通過調節ANRIL-L的表達促進吉西他濱耐藥

作者通過過表達、敲除等實驗證明了ANRIL-L挽救了SRSF3表達改變的腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥性，而ANRIL-S沒有這種作用。western blot和高含量及彗星實驗證實ANRIL-L是影響SRSF3相關DNA修復過程和耐藥性變化的主要因素（圖6O-6R）。綜上所述，SRSF3的表達似乎通過ANRIL選擇性剪接和ANRIL- l的表達增強了胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性。

7. ANRIL-L通過增強DNA HR修復介導吉西他濱耐藥

作者證明了ANRIL-L介導的化療耐藥機制：ANRIL-L通過與RING1b和EZH2形成復合體調控胰腺癌細胞的化療耐藥（附圖7A-P）。接下來分析ANRIL-L敲除耐藥細胞中的HR和NHEJ，發現這些細胞中的HR活性顯著降低（圖6A、6B），并且qPCR數據顯示所選DNA修復RAD50、BRCA1、BRCA2和RAD51 mRNA的水平顯著改變（圖6C）。敲除ANRIL-L表達和吉西他濱治療改變了HR修復相關分子的表達，同時降低了RAD50、BRCA1、BRCA2和RAD51的水平（圖6D）。此外，隨著吉西他濱濃度和耐藥胰腺癌細胞持續時間的逐漸增加，HR分子BRCA1、BRCA2、RAD50和RAD51與ANRIL-L的結合增加（圖6E 6H）。然而，在EZH2或Ring1B表達被敲除后，與ANRIL-L的結合減弱（圖6I-6L）。在耐藥細胞中敲除ANRIL-L表達后，GH2AX與BRCA2和BRCA1的結合減少（圖6M-6P）?；谶@些結果，ANRIL-L能夠與DNA損傷位點結合，與EZH2和Ring1B形成復合物，進而招募RAD50、BRCA1、BRCA2和RAD51蛋白，在細胞經歷DNA損傷修復時促進DNA HR修復過程。

圖6 ANRIL-L復合物通過增強DNA HR修復介導吉西他濱耐藥

8. 胰腺癌組織中SRSF3的表達與ANRIL剪接、Ring1B和EZH2的表達相關

與正常組織相比，胰腺癌組織中ANRIL- l表達水平較高，ANRIL- s表達水平較低（圖7A和7B），胰腺癌組織中ANRIL外顯子1包涵水平顯著高于非癌胰腺組織（圖7C）。結合臨床預后分析，Kaplan-Meier分析顯示高PSI-ANRIL-exon 1腫瘤預后較差（圖7D、7E）。相比之下，高PSI-ANRIL -1外顯子的患者比低PSI ANRIL-L的患者有更多的淋巴結轉移和更大的腫瘤（圖7F和7G）。此外，SRSF3的表達與METTL3存在相關性，證實了SRSF3與m6A修飾之間的相關性（圖7H）。ANRIL外顯子1內含物PSI與腫瘤組織中SRSF3、EZH2和Ring1B的表達相關，進一步支持了這些因子形成復合物調控DNA修復的可能性（圖7I-7K）。這些數據表明胰腺癌組織中SRSF3表達、ANRIL剪接以及Ring1B和EZH2表達之間存在相關性。

圖7胰腺癌組織中SRSF3表達與ANRIL剪接、Ring1B、EZH2表達的相關性

結論：

綜上所述，本研究揭示了SRSF3在胰腺癌化療耐藥調控中的作用及其與胰腺癌預后的關系。SRSF3表達通過ANRIL剪接使胰腺癌細胞對化療藥物脫敏，ANRIL中的m6A甲基化對剪接過程至關重要。證明了SRSF3和SRSF10在調節lncRNA ANRIL可變剪接模式中的作用。此外，m6A甲基化對于lncRNA的剪接過程至關重要。該研究不僅提供了SRSF3誘導ANRIL-L剪接的分子機制，進而在胰腺癌化療耐藥性中形成DNA HR修復復合體，而且還為未來胰腺癌治療的發展提供了一種策略。