細胞周期蛋白依賴性激酶16 (CDK16)是一種非典型的PCTAIRE激酶，其活性依賴于細胞周期蛋白Y (CCNY)家族。CCNYs已被報道調節乳腺干細胞的活性和乳腺的發育，是多種癌癥中的一種癌蛋白。然而，目前尚不清楚CDK16是否在乳腺癌中發揮作用，以及是否可以作為乳腺癌的治療靶點。鑒于此，有相關研究提出CDK16在三陰性乳腺癌（TNBC）中起著關鍵作用，是一種新的TNBC治療靶點，該研究在2022年4月發表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技術路線：

主要研究結果：

1. CDK16在TNBC中高表達，且與不良臨床結果相關

作者分析了CCNY依賴性非典型CDKs的表達和臨床相關性，發現CDK16在所有乳腺癌亞型中均有表達，在基底樣乳腺癌樣本中表達最高(圖1A)。此外，CDK16高表達與不良預后顯著相關(圖1B-D)。與TCGA數據集的結果一致，乳腺癌聯合數據庫(圖1E)和GSE76250數據集(圖1G)也發現TNBC中CDK16表達水平高于正常乳腺組織，且CDK16高表達與不良臨床結果呈正相關(圖1F)。此外，CPTAC數據庫分析顯示，乳腺腫瘤組織中CDK16蛋白表達較正常乳腺組織顯著升高(圖1H)。在所有乳腺癌亞型中，CDK16僅在TNBC中升高(圖1I)。使用組織芯片（T=50, P=4）進行免疫組化(IHC)分析，免疫組化分析顯示，TNBC腫瘤中CDK16蛋白的表達明顯高于鄰近的非癌組織，并主要分布在細胞質中(圖1J)。臨床樣本（N=6, T=6）檢測進一步證實了TNBC中CDK16蛋白表達的增加（圖1K）。這些數據表明高表達的CDK16可能在TNBC的進展中發揮作用。

圖1 CDK16在TNBC中高表達，與不良臨床結果相關

2. 抑制CDK16在體內外均可抑制TNBC的腫瘤生長

集落形成分析顯示，CDK16敲低顯著降低了TNBC細胞的增殖和克隆能力(圖2A, B)。為了確定CDK16的功能是否取決于其酶活性，通過靶向CDK16 3’-UTR的shRNA耗盡內源性CDK16，然后恢復shRNA耐藥的野生型CDK16 (CDK16)或激酶不活化的CDK16D304A突變體(D304A)。盡管過表達效率相當(圖2C)，野生型CDK16而非CDK16D304A突變體可以挽救2D-colony形成分析顯示的細胞增殖缺陷(圖2D, E)，這表明CDK16在TNBC中的功能需要激酶活性。

進一步使用兩個細胞系來源的異種移植(CDX)模型來研究CDK16在TNBC進展中的作用。CDK16基因敲除（CDK16-KD）顯著延遲了異種移植瘤模型的腫瘤形成(圖2F)，抑制了腫瘤生長，與對照組相比，CDK16-KD組的腫瘤體積、質量和大小都有所減少(圖2G-I)。另一種異種移植模型得到了一致的結果(圖2J-M)?？傊?，這些結果表明CDK16對TNBC進展至關重要。

圖2 CDK16敲低可抑制TNBC的體內外腫瘤生長

3. 在患者來源的類器官和異種移植模型中，CDK16的下調抑制TNBC的腫瘤進展

考慮到臨床意義，建立了PDO和PDX模型(圖3A)，以進一步評估靶向CDK16在TNBC中的治療效果。與CDX模型的觀察結果一致，在所有三個PDO模型中，與對照組相比，CDK16-KD組的類器官形成效率和類器官生長顯著降低 (圖3B-D)，表明CDK16敲低抑制了TNBC的進展。類器官Ki67染色分析顯示，CDK16-KD組各類器官中Ki67+細胞的比例明顯低于對照組，對應于CDK16-KD類器官的增殖抑制表型(圖3E)。PDX模型的結果進一步驗證了靶向CDK16在TNBC中的抗腫瘤作用：減緩腫瘤發生(圖3F)，抑制腫瘤生長(圖3G)，最終抑制腫瘤進展(圖3H, I)。綜上所述，這些數據表明靶向CDK16在TNBC的臨床治療中具有巨大的潛力。

圖3在患者來源的類器官和異種移植模型中，CDK16的下調抑制TNBC的腫瘤進展

4. CDK16促進TNBC細胞遷移和腫瘤轉移

乳腺癌患者CDK16表達與轉移復發風險呈正相關，提示CDK16可能參與TNBC轉移。為了驗證這一可能性，通過生物發光成像(BLI)定量監測體內腫瘤轉移。western blot分析證實CDK16過表達(CDK16-OE) (圖4A)。Transwell和愈合化驗顯示，CDK16-OE顯著提升細胞入侵和遷移(圖4 B, C)。體內,老鼠的metastasis-free生存時間軸承CDK16-OE細胞相比明顯縮短小鼠的軸承控制細胞(圖4 d, E)，而CDK16-OE嚴重加重肺轉移負擔 (圖4D, F)和肺轉移結節(圖4G, H)。H&E分析顯示，CDK16-OE導致肺組織嚴重結構損傷(圖4G)。而CDK16-KD顯著降低了4T1細胞的遠端器官轉移(圖4I)，而CDK16-OE過表達顯著促進了EMT6細胞向多個器官的遠端轉移，這在體內和體外BLI數據中得到了證實(圖4J)。總之，這些結果表明CDK16對TNBC轉移至關重要。

圖4 CDK16促進TNBC細胞遷移和腫瘤轉移

5. CDK16通過磷酸化PRC1和調節紡錘體形成來調控細胞增殖

為了研究CDK16參與TNBC進展的分子機制，通過RNA測序分析了CDK16-KD MDA-MB-231細胞和對照細胞的轉錄組。先前文獻報道CDK16與紡錘體有關，同GO分析一樣。因此檢測有絲分裂過程中的紡錘體形成，觀察到CDK16-KD MDA-MB-231細胞中有明顯的紡錘體形成缺陷(圖5A)。免疫印跡分析顯示，T481位點（CDK依賴的主要磷酸化位點）的PRC1磷酸化隨著細胞周期過程中CDK16蛋白的豐度而波動（圖5B），并且在MDA-MB-231細胞中，CDK16敲除后PRC1的磷酸化水平明顯降低（圖5C）。此外，在CDK16敲除后，PRC1靶向基因的表達顯著改變：細胞周期相關基因下調，凋亡相關基因上調(圖5D)。PRC1的亞細胞定位決定了其在細胞增殖中的作用，通過免疫染色(圖5E)和免疫印跡分析(圖5F)，進一步觀察到PRC1在CDK16-KD細胞中明顯的核滯留。

MDA-MB-231細胞的2D增殖分析顯示，磷酸化模擬的PRC1^T481D突變體顯著拯救了受抑制的細胞增殖，而磷酸化缺失的PRC1^T481A突變體則沒有這種拯救作用(圖5G, H)。提示CDK16對TNBC細胞增殖的調控作用是通過磷酸化PRC1實現的。綜上所述，這些結果表明CDK16通過磷酸化PRC1來發揮其在TNBC中的功能。

圖5 CDK16通過磷酸化PRC1和調節紡錘體形成來調控細胞增殖

6. CDK16藥理抑制可抑制TNBC的腫瘤生長和轉移

與TNBC細胞系相比，細胞系MCF-7和T47D對Reb（CDK16抑制劑）敏感性較低(圖6A)。免疫印跡分析顯示，Reb處理降低了T481位點的PRC1磷酸化，并導致PRC1的核保留(圖6B, C)。Reb治療顯著抑制腫瘤生長，從單個腫瘤體積、平均腫瘤體積、腫瘤重量和腫瘤大小可以看出(圖6D-G)。在PDO模型中，Reb存在時腫瘤類器官的大小和數量均顯著減少，但Abe (CDK4/6抑制劑，作為對照)不存在(圖6H, I)。Ki67和cleaved caspase-3的免疫染色評估顯示只有Reb誘導細胞凋亡和抑制細胞增殖(圖6J)。在PDX模型中，也觀察到Reb具有顯著的抗腫瘤效率 (圖6K-N)。Reb能有效抑制MDA-MB-231腫瘤細胞的肺轉移（圖6O,6P）。綜上所述，藥理抑制CDK16可有效抑制TNBC的腫瘤生長和轉移，CDK16可作為治療TNBC的一個有希望的靶點。

圖6 CDK16藥理抑制作用對TNBC腫瘤生長和轉移的抑制作用

7. CDK16抑制參與多種癌癥相關信號通路

Reb治療后的MDA-MB-231細胞進行了轉錄組分析。GSEA分析顯示，在Reb處理的細胞中，有絲分裂紡錘體組織的基因標記(圖7A)和G2/M檢查點(圖7B)下調。Rb-E2F基因標記也受到了Reb治療(圖7C)或CDK16敲除(圖7D)的影響。熱圖顯示，Rb-E2F途徑的靶基因在Reb處理（圖7E）或CDK16敲除（圖7F）后下調。免疫印跡分析證實，在Reb治療（圖7G）或CDK16敲除（圖7H）后，Rb磷酸化顯著降低。此外，通過qPCR分析，Reb治療（圖7I）或CDK16敲除（圖7J）后，受Rb-E2F信號直接調節的基因表達顯著下調?？傊?，這些結果表明CDK16通過磷酸化Rb來調節Rb-E2F信號。綜上所述，這些數據支持CDK16抑制參與多種癌癥相關信號通路，這可能有助于CDK16與PRC1共同調控TNBC進展。

圖7 CDK16抑制參與多種癌癥相關信號通路

結論

CDK16在乳腺癌，尤其是TNBC中高表達，其高表達與不良預后相關，促進TNBC的惡性活動。機制上，CDK16通過磷酸化PRC1和調節有絲分裂期間紡錘體的形成發揮致癌作用。有趣的是，CDK16抑制也抑制Rb磷酸化和Rb-E2F信號?？傊?，該研究為非典型CDK在癌癥中的作用提供了新的見解，并強調CDK16是TNBC一個有希望的治療靶點。

參考文獻

Li X, Li J, Xu L, Wei W, Cheng A, Zhang L, Zhang M, Wu G, Cai C. CDK16 promotes the progression and metastasis of triple-negative breast cancer by phosphorylating PRC1. J Exp Clin Cancer Res. 2022;41(1):149. doi: 10.1186/s13046-022-02362-w.