與正常細胞相比，癌細胞表現出更高水平的氧化應激，這種更高水平的氧化應激也可以被利用來殺死腫瘤細胞，而使正常細胞完好無損。有研究發現Isovalerylspiramycin I (ISP I)，一種新型大環內酯類抗生素，通過靶向核仁蛋白硒蛋白H (SELH)，從而抑制癌細胞生長和腫瘤轉移。該研究于2022年4月發表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技術路線：

主要研究結果：

1. Carrimycin（卡霉素）的結構與合成

卡霉素，主要由4 -O- (ISP) I、II、III和微量的4 -O-酰基螺旋霉素成分組成(圖1A)。對產生卡里霉素的菌株進行基因組測序，發現了一個大約90 kb的生物合成基因簇 (圖1B)。經過糖基化、氧化、酰基化和異戊基化等post-PKS修飾步驟后，ISP I、II和III的結果呈多相混合，差異僅在于碳3上羥基的酰基取代(圖1C)。

圖1卡霉素生物合成基因簇的遺傳結構及ISP I生物合成的主要步驟

2. ISP I抑制腫瘤的發生和轉移

為了評估潛在的細胞毒性，用卡霉素主要成分ISP I、II和III治療膠質母細胞瘤細胞株，并評估細胞活力：50%抑制濃度(IC50)值顯示ISP I最有效，同時膠質母細胞瘤、腎細胞癌(RCC)和腦膜瘤在內的多種腫瘤細胞株對ISP的細胞毒性效應敏感(圖2A和B)。流式分析顯示，ISP I引起細胞周期阻滯和誘導劑量依賴性凋亡(圖2C和D)。進一步用研究ISP I在體內的腫瘤抑制作用(圖2E)。與對照組相比，使用ISP I的小鼠腫瘤生長顯著降低(圖2F和G)。另外，研究兩種不同的、同基因的小鼠肺轉移模型：黑色素瘤(B16)和乳腺癌(4T1)。C57BL/6小鼠靜脈注射B16細胞，隨機分為ISP處理組和鹽水處理組(對照組)(圖2H)。在兩種肺轉移模型中，ISP I顯著降低了肺腫瘤負荷。ISP I治療12天后，與鹽水治療的小鼠相比，B16小鼠肺轉移的數量顯著減少(圖2I和J)。總的來說，這些發現表明，ISP I在體外抑制腫瘤生長。

圖2 ISP I抑制腫瘤生長，減少肺轉移

3.ISP I以SELH為靶點

首先，在LN229細胞中進行了藥物親和反應靶穩定性(DARTS)檢測(圖3A顯示了檢測策略)。質譜分析顯示SELH是ISP處理LN229細胞中最豐富的主要蛋白之一(補充表2)。通過熱穩定性分析，發現ISP I在一系列升高的溫度下保護了SELH(圖3B)，這表明ISP I以SELH為靶點。為了驗證ISP I靶向SELH的特異性，設計了一種表面等離子體共振(SPR)方法來評估ISP I與細菌中合成的過氧化物酶的相互作用，包括SELH、硫氧還蛋白(TrxA)、過氧化氫酶(KatA)和硫醇過氧化物酶(TpX)。ISP I與SELH緊密結合，但不與其他過氧化物酶結合(圖3C)。ISP I在多種腫瘤細胞株中以劑量依賴的方式降低了SELH蛋白的表達(圖3D和E)。環己酰亞胺(CHX)追蹤實驗證實，ISP I處理降低了SELH蛋白的半衰期，這表明ISP I促進了SELH蛋白的降解(圖3F和G)。總的來說，這些結果表明，ISP I靶向SELH并促進SELH蛋白降解。

為了證實ISP I通過SELH依賴機制抑制細胞生長，用CRISPR-Cas9生成了SELH缺失的LN229和RCC細胞株(分別為786-O和RCC4)。與野生型細胞相比，SELH缺陷細胞能抵抗ISP I處理(圖3H)。使用選擇性siRNA敲除，SELH抑制顯著降低了細胞生長速率，延緩了細胞增殖，增加了細胞凋亡(圖3I-K)。為了評估SELH是否在體內調節腫瘤生長，將野生型或SELH缺失的LN229細胞原位注射給NSG小鼠：結果發現SELH-deficient小鼠總生存期增加了近兩倍(SELH-deficient LN229組：野生型LN229組=51天：28天，圖3L)。C57BL/6小鼠注射野生型B16細胞或SELH缺陷B16細胞(圖3M - O)。尾靜脈接種12天后，與注射野生型B16細胞的小鼠相比，SELH缺陷B16細胞的小鼠患肺腫瘤的幾率顯著降低(圖3N-O)。因此，ISP I通過抑制SELH抑制原發和轉移性腫瘤的生長。

圖3 ISP I以SELH為目標

4. ISP I破壞細胞內氧化還原穩態

由于硒蛋白可以保護機體免受活性氧的侵害，因此研究ISP I是否改變了體外氧化還原穩態。首先，評估ISP對谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響：ISP I處理的LN229細胞谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著降低(圖4A)。ROS-Glo H₂O₂檢測證實，ISP處理過的腫瘤細胞內ROS水平升高(圖4B)。MitoSOX染色，然后流式細胞儀檢測，顯示ISP I處理后的細胞內ROS升高，且呈劑量依賴性(圖4C和D)。

下一步評估ISP I是否改變抗氧化下游信號通路。經ISP I處理的LN229細胞的轉錄組分析和GSEA均顯示氧化途徑的廣泛改變以及核因子紅系2相關因子2 (NFE2L2/NRF2)的特異性上調(圖4E和F)。在ISP I處理的細胞中，NFE2L2的表達顯著上調；ISP I誘導NFE2L2信號通路下游靶蛋白HMOX1和NQO1的增加(圖4G和H)。過表達SELH降低了NFE2L2蛋白水平，而在SELH沉默的細胞中NFE2L2蛋白水平升高(圖4I)。NFE2L2 mRNA在SELH沉默的U251細胞中略有增加(圖4J)。SELH沉默的細胞HMOX1 mRNA顯著增加，與NFE2L2蛋白的增加一致(圖4K)。通過抑制SELH, ISP I誘導ROS積累并激活抗氧化信號通路，包括NFE2L2通路。

圖4 ISP I觸發ROS積累和氧化應激反應通路

5. ISP I觸發DNA損傷和R-環的形成

由于細胞內ROS水平的增加導致氧化性DNA損傷，從而誘導基因組不穩定性并抑制細胞周期進展，因此評估ISP I治療是否增強了癌細胞的DNA損傷。免疫熒光染色和western blot分析顯示，ISP I處理的細胞顯示出較高數量的γH2AX，這是DNA損傷的敏感標記(圖5A和B)。ISP I處理的細胞以劑量依賴性的方式顯示R-loop積累增加(圖5C和D)。ISP I以劑量依賴性的方式減少EdU摻入DNA(圖5C和I)。γH2AX和EdU顯示，ISP I處理不僅持續增加DNA損傷和減少DNA復制，而且改變R-環定位(圖5C, E-J)。在ISP I處理的U251細胞中，R-環病灶集中在核漿而不是核仁(圖5C)。R-環位點特異性地定位于DNA損傷位點，而不是DNA復制位點(圖5G和J)。此外，在ISP i處理的U251細胞中發現了核仁離域，這是核仁應激的證據(圖5C)。 總的來說，ISP I顯著增加細胞內ROS水平，降低DNA復制，導致DNA損傷和R-環的形成。 

圖5 ISP I觸發DNA損傷和R環形成，并改變R環的定位

6. ISP I通過JNK2/TIF-IA通路抑制核仁rRNA轉錄

免疫熒光成像顯示，ISP I處理的LN229細胞核仁蛋白分散度增加，核仁內SELH表達顯著降低(圖6A)。ISP I處理LN229細胞后，NPM1蛋白水平下降，p53(凋亡標志物)升高，且呈劑量依賴性(圖6B)。GSEA分析證實了p53通路的誘導(圖6C和D)。為了評估核糖體生物發生的改變并探索與核仁功能障礙的潛在聯系，接著分析了pre-rRNA轉錄：ISP I以劑量依賴的方式減少pre-rRNA（POLI轉錄本）（圖6E）。ISP I以劑量依賴的方式增加JNK2磷酸化，表明細胞ros誘導的JNK2激活升高(圖6F)。雖然ISP I處理導致了POLI和TIF-IA表達的輕微下降趨勢，但免疫共沉淀分析顯示，在ISP I處理或SELH缺失的LN229細胞中，TIF-IA和POLI之間的生理相互作用被顯著破壞(圖6G)：提示激活的JNK2在SELH缺失細胞中主要削弱了TIFI-IA和POLI的相互作用。CHIP分析顯示，在ISP I處理或SELH缺陷的LN229細胞中，POLI補充到啟動子和rDNA編碼區的量減少(圖6H)。這表明，ISP I通過激活ROS/JNK2/TIF-IA通路，抑制了SELH受損的POLI-rDNA相互作用。這些發現表明，ISP I通過抑制POLI轉錄而破壞了核糖體的生物發生，但并不改變成熟的RNA機制。

圖6 ISP I誘導核仁應激反應

結論：

一種新型的重組大環內酯類抗生素通過抑制特定蛋白質SELH在核仁中發揮有效的抗癌作用。這會破壞RNA聚合酶I，導致輕微但災難性的DNA損傷，并導致細胞周期停滯和腫瘤細胞凋亡，從而造成癌細胞的脆弱性。ISP I對小鼠正常組織的有害影響最小，專門針對SELH。通過利用SELH抑制作用，ISP I揭示了腫瘤細胞中一種獨特的脆弱性。通過利用SELH抑制，將ROS穩態的紊亂與核糖體合成功能障礙聯系起來，ISP I揭示了腫瘤細胞特有的脆弱性。因此，核仁和SELH是有希望的癌癥治療靶點。

參考文獻：

Cui J, Zhou J, He W, et al. Targeting selenoprotein H in the nucleolus suppresses tumors and metastases by Isovalerylspiramycin I. J Exp Clin Cancer Res. 2022; 41(1):126. doi: 10.1186/s13046-022-02350-0.