結(jié)直腸癌(CRC)是世界范圍內(nèi)最常見、最致命的腫瘤之一。大多數(shù)的CRC對(duì)以抗程序性細(xì)胞死亡蛋白-1 (PD-1)為基礎(chǔ)的癌癥免疫治療耐藥。約15%具有高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、高腫瘤突變負(fù)擔(dān)和腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞已經(jīng)成為轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。PD-1信號(hào)通路激活致癌功能，而在肺癌細(xì)胞中，它具有腫瘤抑制作用。本研究工作旨在評(píng)估抗PD -1 尼魯單抗 (NIVO)藥物治療CRC的效果。本研究于2022年3月發(fā)表于《Journal for Immuno Therapy of cancer》，IF=13.751。

本文技術(shù)路線：

本文主要內(nèi)容：

1. PD-1阻斷增加結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)

首先，在人結(jié)腸癌細(xì)胞中評(píng)估PD-1和PD-L1水平。在HT29、HCT116、LoVo、SW620和Colo205細(xì)胞中檢測(cè)到PD-1，但未檢測(cè)到PD-L1 (Fig 1A)。與SW620和Colo205細(xì)胞相比，HT29、HCT116和LoVo細(xì)胞明顯過表達(dá)PD-1。已有研究表明，當(dāng)IFN誘導(dǎo)PD-L1時(shí)，I型(IFN-α)和II型(IFN-γ)干擾素帶來的影響取決于PD-1和PD-L1的表達(dá)。在HT29和HCT116細(xì)胞蛋白水平和轉(zhuǎn)錄組水平上，IFN-α和IFN-γ均不能誘導(dǎo)PD-1，而IFN-α和IFN-γ均能誘導(dǎo)PD-L1 (Fig 1B)。為評(píng)估細(xì)胞PD-1信號(hào)通路在結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT29、HCT116和LoVo用可溶性PD-L1和 NIVO進(jìn)行處理。如Fig 1C所示，sPD-L1增加了HT29、HCT116和LoVo細(xì)胞凋亡。如Fig 1D所示，NIVO促進(jìn)了細(xì)胞增長(zhǎng)，而sPD-L1抑制了其生長(zhǎng)。 在HT29和HCT116細(xì)胞中，六個(gè)小時(shí)NIVO(10 μM)處理誘導(dǎo)pERK表達(dá)，但是NIVO (10 μM)降低了人黑色素瘤細(xì)胞PES43的pERK (Fig 1E)。

此外，6小時(shí)NIVO(10 μM)增加了HT29中pP38的含量，但NIVO對(duì)K-RAS突變細(xì)胞HCT116中的pP38無影響(Fig 2C)。相反， 6小時(shí)NIVO(10 μM)處理減少了PES43中pP38水平，這些數(shù)據(jù)表明PD-1通過抑制P38和ERK信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖。

為了進(jìn)一步研究下游信號(hào)通路在PD-1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖中的作用，作者在MEK/ ERK1/2/AKT/P38抑制劑存在下評(píng)價(jià)HT29和HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激酶抑制劑顯著恢復(fù)了NIVO誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞的生長(zhǎng)。在HCT116中，AKT和MEK/ERK1/2抑制劑都能恢復(fù)NIVO誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)，而正如預(yù)期的那樣，P38抑制劑不影響細(xì)胞增殖。

Fig 1 PD-1阻斷增加結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)

 
2.NIVO保護(hù)結(jié)腸癌細(xì)胞免受化療/放療傷害，并增強(qiáng)球狀生長(zhǎng)

為了研究PD-1信號(hào)通路對(duì)化療的影響，作者在 NIVO存在的情況下，用5-FU、OXA、CDDP、DOXO、IRI和TAX治療人結(jié)腸癌細(xì)胞72小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NIVO 降低了化療療效，增加了HT29、HCT116和LoVo的5-FU、OXA和IRI水平。此外，在HT29、HCT116和LoVo細(xì)胞中，5-FU和OXA加入NIVO后，細(xì)胞凋亡率降低(Fig 2A)。

NIVO存在的HCT116和HT29細(xì)胞暴露于2-4-8 Gyx射線中(Fig 2B i)。在HT29和HCT116細(xì)胞中，NIVO增強(qiáng)了對(duì)輻射的抵抗力，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)(Fig 2B i)。NIVO- f (ab)2 (1μM)處理與NIVO處理效果相同(Fig 2B ii)。

此外，為了重現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的三維相互作用和相對(duì)藥物敏感性，將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、HCT116和SW620在球體和NIVO/中進(jìn)行三維培養(yǎng)評(píng)價(jià)NIVO + OXA療效。從圖2C中可以看出，在HT29種用NIVO處理(10 μM)增強(qiáng)了HT29的球體平均面積，而在HT29、HCT116、HT29OXA、SW620中處理顯著減少了的球體平均面積?？傊?，NIVO抑制了OXA對(duì)HT29和HCT116球形細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，但對(duì)低表達(dá)PD-1的SW620細(xì)胞無影響。

Fig2 NIVO保護(hù)結(jié)腸癌細(xì)胞免受化療/放療傷害，并增強(qiáng)球狀生長(zhǎng)

3. NIVO誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞差異基因表達(dá)

對(duì)HT29 和HCT116細(xì)胞用NIVO、sPD-L1、sPD-L1+NIVO進(jìn)行6-24小時(shí)NIVO處理，并與PES43細(xì)胞比較，進(jìn)行RNA測(cè)序。確定結(jié)腸癌細(xì)胞中治療影響的基因。如圖3A中的主成分分析(PCA)所示，HCT116、HT29和PES43獨(dú)立的聚為3類。6個(gè)小時(shí)的處理后，在PES43，HT29和HCT116中發(fā)現(xiàn)8306，618和3846個(gè)差異表達(dá)基因。24個(gè)小時(shí)的處理后，在PES43，HT29和HCT116中發(fā)現(xiàn)73121147和5410個(gè)差異表達(dá)基因。

作者重點(diǎn)研究了HT29、HCT116和PES43中共同調(diào)控的基因，分別在NIVO治療6小時(shí)和24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)了149個(gè)和299個(gè)共同基因(Fig 3C)。在NIVO治療6小時(shí)和24小時(shí)時(shí)分別篩選19個(gè)(NIVO-6小時(shí))和67個(gè)(NIVO-24小時(shí))與PES43相關(guān)(Fig 3D)。

在處理6小時(shí)時(shí)，BATF2， IFIT3和TNFRSF11A在PES43中表達(dá)上調(diào)(Fig 4)。因此，6小時(shí)的NIVO治療可能會(huì)影響HT29和HCT116的基因表達(dá)，使HT29和HCT116具有更強(qiáng)的侵襲性表型，而PES43具有較弱的侵襲性表型，腫瘤抑制因子的減少和先天免疫反應(yīng)、1-IFN信號(hào)通路和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路的調(diào)控基因相關(guān)，這些特征在治療24小時(shí)內(nèi)保持不變(Fig 4)。在處理6個(gè)小時(shí)和24個(gè)小時(shí)的HT29和HCT116細(xì)胞中中分別篩選12個(gè)基因進(jìn)行 qRT-PCR驗(yàn)證，得到相同的結(jié)果。

Fig3 NIVO處理的人類結(jié)腸癌和黑色素瘤細(xì)胞中的差異表達(dá)基因(DEGs)

Fig4 Nivo處理的人類結(jié)腸癌和黑色素瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因(DEGs)的Go富集分析

4. NIVO增強(qiáng)HT29腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)

以HT29異種移植模型評(píng)價(jià)NIVO效應(yīng)。將HT29細(xì)胞接種于CD1胸腺病小鼠，當(dāng)腫瘤達(dá)到50 mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為四組，每周兩次腹腔注射PBS (n=6)、NIVO (n=6)、OXA (n=6)以及NIVO +OXA聯(lián)合(n=6)治療3周。用HE評(píng)估腫瘤組織學(xué)。與體外實(shí)驗(yàn)一致，NIVO顯著增加腫瘤生長(zhǎng)1.88倍(Fig 5A)，提示PD-1阻斷可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，降低化療療效。同樣，與對(duì)照組相比，NIVO組腫瘤體積增大(Fig 5B)。與未處理組和與OXA聯(lián)合組相比，NIVO顯著增加了Ki-67表達(dá)細(xì)胞的比例(p=0.023) (p=0.027) (Fig 5C)。此外，NIVO和cleaved caspase-3檢測(cè)結(jié)果顯示，NIVO + OXA顯著降低了凋亡細(xì)胞的比例。此外，nivo處理的腫瘤與未處理的腫瘤相比，P38表達(dá)水平更高。有趣的是，在OXA處理的腫瘤中，pP38陽性細(xì)胞顯著降低(p=0.0061)，而在NIVO + OXA處理的腫瘤中，pP38陽性細(xì)胞增加(p=0.0047)，表明NIVO處理的腫瘤中細(xì)胞增殖更高。此外，與OXA治療組相比，OXA + NIVO組pERK1/2顯著升高。

癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫顯示，PD-1編碼的PDCD1基因在包括CRC在內(nèi)的17種癌癥中被廣泛轉(zhuǎn)錄。然而，結(jié)腸癌組織中有浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞。通過免疫組化分析48份石蠟包埋的結(jié)腸癌樣本中PD-1的表達(dá)情況。PD-1在TME和癌細(xì)胞中表達(dá)。臨床病理特征顯示原發(fā)性腫瘤的大小與PD-1的表達(dá)顯著相關(guān)，而且PD-1主要在結(jié)腸癌黏液組織中表達(dá)。

Fig5 PD-1阻斷加速皮下HT29腫瘤生長(zhǎng)，降低化療療效

本提供了第一個(gè)PD-1靶向?qū)е陆Y(jié)腸癌放射/化療耐藥的報(bào)告。腫瘤細(xì)胞固有的PD-1/總PD-1表達(dá)可能代表CRC患者免疫檢查點(diǎn)阻斷選擇的潛在生物標(biāo)志物。PD-1在結(jié)腸癌中的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)

Ierano, C., et al., In PD-1+ human colon cancer cells NIVOLUMAB promotes survival and could protect tumor cells from conventional therapies. J Immunother Cancer, 2022. 10(3).