FLNC截斷突變（FLNCtv）是遺傳性擴張型心肌病（DCM）的常見病因，是發展成心律失常性心肌病的高危因素。本研究結果表明，PDGFRA信號通路與DCM發病機制有關，抑制該通路可能是flnc相關心肌病的一種治療策略本研究于2022年2月發表在《Science Advances》IF:14.136雜志上。

技術路線：

主要研究結果：

1、使用患者特異性多能干細胞來源的心肌細胞（iPSC-CMs）構建FLNC-相關DCM模型

作者從FLNC^G1891Vfs61X和FLNC^CE2189X的DCM患者身上分離出iPSC細胞，然后誘導成iPSC-CMs，并探究其電生理學屬性，結果顯示與健康對照組相比，FLNCtv患者的iPSC-CMs均表現出較弱的收縮性和較慢的放松性（Fig. 1 A and B）。兩種患者特異性iPSC-CMs也表現為自發性心律失常（Fig. 1 C）。與對照組iPSC-CMs相比，心律失常表型也表現為心率的較大變異（Fig. 1 D）。為了進一步驗證心律失常的表型，檢測了健康和iPSC-CMs患者的動作電位(AP)形態。與收縮數據一致，40%的FLNC^G1891Vfs61X和36%的FLNC^CE2189X 的iPSC-CMs與對照iPSC-CMs相比出現異常AP形態（Fig. 1 E and F）。總之，這些數據表明，FLNC患者iPSC-CMs概述了體外與FLNC相關的DCM相關的心律失常表型。

圖1 FLNC^G1891Vfs61X and FLNC^E2189X iPSC-CMs 表現出收縮性受損和心律失常

2、FLNC^G1891Vfs61X和FLNC^CE2189X都是缺失突變體其導致FLNC相關心肌病的單倍機能不全

接下來檢測了患者特異性iPSC-CMs中FLNC的表達水平，通過免疫印跡和qPCR檢測發現，與對照組iPSC-CMs相比，FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X突變體表達FLNC蛋白和mRNA水平均顯著降低（Fig. 2 A to C）。盡管FLNC表達水平降低，但通過免疫熒光染色和共定位分析，能夠在兩個FLNC突變的iPSC-CM細胞系中檢測到FLNC及其與α- actitin在Z-discz盤的共定位（Fig. 2D）。

為了探究FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X是否是功能丟失的突變體，為FLNC缺失的iPSC系和等基因對照系細胞生成了差異表達基因(DEG)譜，并與iPSC- CMs患者的DEG譜進行了比較。結果顯示成功構建了FLNC純合子（FLNCKO?/?）和雜合子（FLNCKO+/?）敲除的iPSC-CMs（Fig. 2 E to H）。FLNCKO?/?和FLNCKO+/?iPSC-CMs中FLNC的表達在mRNA和蛋白水平上均以等位基因依賴的方式顯著降低。RNA測序生物信息學分析顯示，FLNC截斷突變中的DEGs與FLNC KO iPSC-CMs中的DEGs呈正相關，支持功能缺失是FLNC突變引起表型表現的主要機制（Fig. 2I）。此外，攜帶FLNC突變的iPSC-CMs顯著降低了ID蛋白水平；FLNC KO iPSC-CMs也有相同的發現（Fig. 2J）。最后，FLNCKO?/?細胞表現出與患者iPSC-CMs相似的心律失常表型（Fig. 1 E and F）。總之，這些結果說明FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X都是缺失突變體其導致FLNC相關心肌病的單倍機能不全。

圖2 FLNC^G1891Vfs61X and FLNC^E2189X的功能缺失突變導致FLNC相關心肌病的單倍機能不全

3、FLNC缺失導致β-Catenin核定位和β-Catenin信號通路的激活

為了發現FLNC的分子伴侶，進行了共免疫沉淀和蛋白質組學分析，通過蛋白質組學分析確定了β-Catenin，經免疫印跡證實（Fig. 3A）。在FLNC^KO?/? iPSC-CMs的裂解液中沒有檢測到β-Catenin，而且在FLNC突變的iPSC-CMs的裂解液中β-Catenin的水平也減少了（Fig. 3A）。此外，在FLNC -突變體和FLNC^KO?/? iPSC-CMs的細胞核中檢測到大量的β-Catenin，而對照iPSC-CMs中β-Catenin主要在細胞質中檢測到（Fig. 3B-C）。此外，FLNC -突變體和FLNC^KO?/? iPSC-CMs的RNA-seq數據表達譜顯示β-Catenin信號通路激活（Fig. 3D）。總之，數據表明β-Catenin可能是一種新的FLNC結合伙伴和FLNC的下游效應物，并且iPSC-CMs中FLNC的缺失導致β-Catenin從胞漿遷移到細胞核，導致β-Catenin信號的激活。

圖3 β-Catenin與FLNC和FLNC激活的β-Catenin信號通路的缺失有關

4、PDGFRA在FLNC相關心肌病中上調并且是β-Catenin的下游調控因子

為鑒定更多的下游靶點用于藥物開發，作者比較了FLNC^KO?/?和FLNC^KO+/?的iPSC-CMs的轉錄組以鑒定潛在靶基因。如圖Fig. 4A所示，FLNC^KO?/?和FLNC^KO+/?的iPSC-CMs的轉錄組有接近相似的上調和下調DEGs。對兩者間共有的上調和下調DEGs進行KEGG分析，發現它們主要參與調控cell-cell adhesion, intercellular communication，ion transport等通路（Fig. 4B to D）。此外，這些上調的DEGs主要富集至PDGF分子水平的結合活性（Fig. 4E）。數據顯示，與等基因對照的iPSC-CMs相比，FLNC KO系中PDGFRA的表達水平顯著提高了4倍（Fig. 4F）。由于數據表明，FLNC^G1681Vfs61X和FLNC^E2189X突變導致單倍功能不全，作者假設攜帶這些突變的iPSC-CMs患者的PDGFRA水平也可能升高。如Fig. 4G to H所示，與對照組相比，兩種患者來源的iPSC-CMs中PDGFRA均上調。總之，這些發現提示PDGFRA信號通路的激活與FLNC相關心肌病的發病機制有關。

圖4細胞粘附途徑的失調導致PDGFRA在FLNC相關心肌病發病機制中的激活

β-Catenin被認為可以上調PDGFRA在其他組織和/或疾病中的表達。由于觀察到β-Catenin在FLNC缺失的iPSC-CMs中有顯著的核定位，于是研究了β-Catenin是PDGFRA上游轉錄激活因子的假設。因此，使用β-Catenin抑制劑(JW67和JW74)在不同濃度下抑制β-Catenin，并觀察到PDGFRA轉錄水平的劑量依賴性抑制（Fig. 5A）。此外，ChIP下拉實驗表明，已知的轉錄因子和β-Catenin結合伙伴SOX2與PDGFRA啟動子區結合（Fig. 5B）。總之，數據表明β-Catenin是PDGFRA的轉錄激活因子，并且β-Catenin的核定位導致PDGFRA在FLNC缺失的iPSC-CMs中持續上調。

圖5 β-Catenin可能是PDGFRA的轉錄激活因子

5、PDGFRA抑制挽救了connexin 43的膜定位

研究顯示PDGFRA通過激活MAPK/ERK信號通路，破壞細胞膜上connexin43（縫隙連接蛋白-1 (GJA1)）的信號。作者發現，與對照iPSC-CMs相比，FLNC突變體和KO iPSC-CMs的ERK激活并且GJA1離開細胞膜（Fig. 6A）。為了測試FLNC單倍不足的iPSC-CMs中PDGFRA的激活是GJA1定位錯誤的原因，使用FDA批準的藥物crenolanib對PDGFRA進行藥物抑制，以確定對GJA1膜定位的影響。免疫熒光研究表明，crenolanib抑制PDGFRA可以挽救GJA1在膜上的定位（Fig. 6A）。

轉錄組分析顯示，與FLNCG1891Vfs61X和KO iPSC-CMs相比，FLNCE2189X突變體iPSC-CMs對crenolanib的反應最大，拯救的DEGs數量最多（Fig. 6B）。GSEA揭示了細胞粘附途徑(hsa04510)的部分正常化，支持了cell-cell adhesion位點的結構穩定促進了GJA1粘附在細胞膜上的假設（Fig. 6C）。然而，通過免疫印跡檢測，發現crenolanib處理后GJA1的表達水平沒有改變，這表明PDGFRA抑制并不影響GJA1的表達水平，而是影響GJA1的轉運（Fig. 6D）。最后，也是最重要的一點是，crenolanib處理也顯著改善了來自FLNC患者的iPSC-CMs的收縮性，并減少了心律失常，但對健康對照組而言并非如此（Fig. 6E-F）。綜上，說明FLNC缺失導致細胞-細胞黏附系統失調，抑制PDGFR信號通路改善FLNC突變體iPSC-CMs的收縮性.

圖6 FLNC缺失導致細胞-細胞黏附系統失調，抑制PDGFR信號通路改善FLNC突變體iPSC-CMs的收縮性

6、PDGFRA抑制減弱了β-catenin核定位

通過免疫熒光檢測到，與對照組iPSC-CMs相比，FLNC突變體iPSC-CMs中β-catenin的核定位增加，但在crenolanib處理后，β-catenin的核定位減少（Fig. 7A）。qPCR證實crenolanib處理對β-catenin核信號轉導的抑制作用，β-catenin靶基因TCF4、SOX9、COL1A2、TGF 3的轉錄水平降低（Fig. 7B）。此外，通過GSEA分析比較crenolanib治療前后患者源性和KO iPSC-CMs的DEGs譜，進一步證實PDGFRA信號抑制后β-catenin信號通路部分恢復（Fig. 7C-D）。因此，證據表明PDGFRA的激活增強了β-catenin信號，并促進了一個正反饋回路。此外，PDGFR抑制可以部分恢復β-catenin膜定位，減少FLNCtv突變引起的β-catenin的激活。

圖7 PDGFRA抑制減緩了β-catenin信號通路及其在FLNC突變體iPSC-CMs中的核定位

7、a-DCM中PDGFRA信號的激活

為了證實體外研究的結果，測定了a-DCM患者心臟中PDGFRA的表達水平。在a-DCM患者中(n = 5)， 1例患者是FLNC^G1891V61X突變的姐妹。另外4例患者診斷為特發性DCM合并室性心律失常。發現a-DCM患者心臟PDGFRA水平升高， PDGFRA下游效應物ERK被激活（Fig. 8A and B）。此外，還確定了β-catenin和GJA1在DCM心臟中的表達水平和定位。雖然β-catenin和GJA1的表達水平結果保持不變，但免疫熒光染色檢測到β-catenin和GJA1從細胞膜上分離（Fig. 8C and E）。此外，移植心臟的RNA-seq數據顯示，與DCM (n = 15)和未衰竭心臟(n = 12)相比，a-DCM (n = 20)心臟中PDGFRA mRNA的豐度顯著更高（Fig. 8F）。RNA-seq數據經qPCR驗證，如Fig. 8G所示。此外，各組間PDGFRB mRNA轉錄水平未發生變化，提示FLNC突變引起a-DCM的致病機制是特異性于PDGFRA亞型的（Fig. 8F）。總之，證實了來自患者特異性和KO iPSC-CM系和人類a-DCM移植心臟的體外發現，強烈表明PDGFRA促進a-DCM的致病信號傳導。

圖8 PDGFRA的上調有助于GJA1和β-catenin在心律失常性擴張型心肌病心臟的離域

總之，如圖9，本研究發現β-catenin是FLNC的下游靶點，FLNC單倍不足不僅影響cell-cell adhesion、細胞骨架和肌肉組織，還增加β-catenin的核遷移，進而上調PDGFRA的轉錄。隨后PDGFRA信號的激活可能是FLNC突變體iPSC-CMs中觀察到的收縮功能障礙和電不穩定的原因。FLNC 單倍不足和隨后PDGFRA激活引起的心律不齊的表現型至少部分是由于GJA1位移引起的細胞膜的幾種機制導致的，如PDGFRA下游靶點ERK磷酸化，ID中斷和異常易位。

圖9 FLNC相關心肌病的疾病模型

參考文獻：

Chen Suet Nee., Lam Chi Keung., Wan Ying-Wooi., Gao Shanshan., Malak Olfat A., Zhao Shane Rui., Lombardi Raffaella., Ambardekar Amrut V., Bristow Michael R., Cleveland Joseph., Gigli Marta., Sinagra Gianfranco., Graw Sharon., Taylor Matthew R G., Wu Joseph C., Mestroni Luisa.(2022). Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Adv, 8(8), eabk0052. doi:10.1126/sciadv.abk0052