流行病學研究證實，晝夜節律異常與乳腺癌的發生有關。然而，很少有研究探討節律基因在乳腺癌進展中的病理作用。目前，有研究發現節律基因NFIL3在體外和體內均能促進乳腺癌細胞的增殖和轉移，該研究發表在《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》，IF：11.161。

技術路線：

主要研究結果：

1. NFIL3 mRNA的減少表明，通過篩查乳腺癌節律基因的異常表達，TNBC中NFIL3蛋白升高

作者從基于TCGA數據集和GTEx數據集，搜索GEPIA數據庫，研究了32個節律基因在乳腺癌中的異常表達，其中與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中CRY2、NFIL3、PER1、EGR3、NR1D1和TIMELESS 6個節律基因的表達發生了顯著變化（圖1A）。q-PCR結果驗證了這6個節律基因在臨床樣本的mRNA水平，證實了NFIL3和EGR3在乳腺癌中的異常表達與GEPIA數據庫的結果一致(圖1B)。EGR3 mRNA在HER2陽性乳腺癌亞型中顯著下調，而NFIL3 mRNA在TNBC亞型中特異性低于其他亞型乳腺癌(圖1C)。因此，作者選擇NFIL3做后續研究。免疫組化評估NFIL3蛋白在TNBC和其他亞型乳腺癌之間的表達，發現NFIL3蛋白在TNBC中的表達明顯高于其他亞型乳腺癌(圖1D)，這與NFIL3在TNBC中的表達模式的mRNA水平相反(圖1C)。此外， NFIL3蛋白高表達與TNBC患者預后不良相關(圖1E)。

ChIP (圖1F)和雙熒光素酶報告基因 (圖1G)證明NFIL3可以結合NFIL3基因的啟動子區域并抑制其轉錄。這表明NFIL3是NFIL3基因轉錄的抑制因子，這可能解釋了NFIL3在mRNA和蛋白水平上的相反變化。后續作者發現隨著外源性NFIL3蛋白的增加，NFIL3的pre-mRNA顯著下調(圖1I)。這些結果表明，NFIL3是NFIL3轉錄的一個轉錄抑制因子，并且NFIL3 mRNA的下降表明癌癥中NFIL3蛋白水平的升高。

圖1 NFIL3 mRNA下降提示TNBC中NFIL3蛋白升高

2. NFIL3蛋白促進TNBC細胞的增殖和轉移

為了檢測NFIL3蛋白在TNBC進展中的潛在作用，分別通過功能獲得和功能缺失實驗研究了NFIL3蛋白對兩種TNBC細胞株BT549和Hs578T增殖和轉移的影響：增加NFIL3蛋白促進Hs578T細胞增殖(圖2A-B)，而內源性NFIL3基因的下調抑制了Hs578T細胞的增殖(圖2C, D)；上調NFIL3蛋白可促進Hs578T細胞的生長(圖2E)，而下調NFIL3蛋白可抑制Hs578T細胞的生長(圖2F)；過度NFIL3蛋白質促進Hs578T細胞遷移和入侵(圖2),而減少NFIL3蛋白抑制細胞遷移和入侵 (圖2 j-l)；上調NFIL3蛋白可促進Hs578T細胞的肺轉移(圖2M)，而下調NFIL3蛋白可抑制Hs578T細胞的肺轉移(圖2N)。這些表明NFIL3蛋白可促進TNBC細胞在體外和體內的進展。

圖2 NFIL3促進TNBC細胞在體外和體內的增殖和轉移

3. NFIL3調節乳腺癌中的腫瘤相關炎癥

作者使用mRNA陣列檢測了NFIL3敲除后的整體基因表達變化。功能富集分析表明，下調和上調的基因在炎癥中均顯著富集(圖3A, B)。NFIL3敲除影響的主要炎癥通路：先天免疫信號通路和適應性免疫信號通路顯著豐富(圖3C)。基于TCGA數據集，分析NFIL3 mRNA水平與乳腺癌組織中22個炎性細胞浸潤的相關性(圖3D-E)：NFIL3 mRNA水平與I型巨噬細胞(M1)、CD4+記憶T細胞、CD8+ T細胞、樹突狀細胞(DCs)、濾泡T輔助細胞、M0細胞和中性粒細胞的浸潤水平呈正相關(圖3D)，而與Treg細胞、II型巨噬細胞(M2)、單核細胞、靜息肥大細胞、na?ve CD4+ T細胞、γδ T細胞和嗜酸性粒細胞水平呈負相關(圖3E)。此外，在60個TNBC組織中檢測了NFIL3蛋白水平與浸潤M1、M2、CD8+T細胞數量的相關性，證實NFIL3蛋白水平與浸潤M2細胞呈正相關，與浸潤M1細胞、CD8+T細胞呈負相關(圖3F-G)。這些結果表明，NFIL3在乳腺癌中調節腫瘤相關的炎癥。

圖3 NFIL3調節乳腺癌中的癌相關炎癥

4. NFIL3通過抑制TNBC細胞中NFKBIA的表達增強NF κB信號通路的活性

NF-κB信號通路是一個與癌癥進展相關的炎癥通路，在NFIL3調控的十大炎癥信號通路中富集(圖3C)。免疫熒光實驗中，TNF-α刺激后，NF-κB迅速從細胞質轉位至細胞核，NFIL3蛋白的過表達顯著增強NF-κB在不同時間點入核的轉位，而NFIL3蛋白的減少阻斷了NF-κB的核轉位(圖4A)。隨后，雙熒光素酶報告基因實驗證實，過表達NFIL3蛋白顯著增強NF-κB活性，而敲低NFIL3蛋白顯著抑制NF-κB活性(圖4B)。這些結果表明，NFIL3能有效促進TNBC細胞NF-κB的活化。

考慮到NFIL3是一個轉錄抑制因子，NF-κB激活的典型抑制因子NFKBIA在NFIL3敲除細胞中顯著上調，將NFKBIA作為NFIL3的直接靶點進行進一步研究。采用ChIP試驗和雙熒光素酶報告基因試驗證明，在Hs578T細胞中，NFIL3結合NFKBIA基因(圖4C)并抑制其轉錄(圖4D)。NFKBIA在NFIL3過表達細胞中下降，但在NFIL3敲除細胞中，在Hs578T細胞(圖4E-F)。此外，免疫組化檢測乳腺癌組織中NFIL3和NFKBIA的蛋白水平，發現乳腺癌組織中NFIL3蛋白水平與NFKBIA蛋白水平呈負相關(圖4G)。TCGA數據集中NFIL3和NFKBIA的相關性，發現NFIL3 mRNA與NFKBIA mRNA在乳腺癌(圖4H)中均呈正相關。這些結果表明NFKBIA是NFIL3蛋白的直接靶點，在TNBC細胞中被NFIL3轉錄抑制。

圖4 NFIL3增強NF-κB信號通路活性，抑制TNBC細胞中NFKBIA的轉錄

5. NFKBIA抑制NF-κB信號通路的活性，抑制TNBC細胞在體內外的增殖和轉移

NF-κB基因的下調增強了NF-κB從細胞質進入細胞核的易位，而NFKBIA的過表達阻斷了Hs578T細胞中NF-κB的核易位(圖5A)。NF-κB活性顯著增強，而NF-κB過表達顯著抑制NF-κB活性(圖5B)。此外，基于TCGA數據集，分析NFKBIA mRNA水平與乳腺癌組織中22個炎癥細胞浸潤的相關性(圖5C, D)，發現NFKBIA mRNA水平與M1、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞和na?ve B細胞的浸潤水平呈正相關(圖5C)，而根據TCGA數據集，與乳腺癌組織中M2細胞、靜息肥大細胞和嗜酸性粒細胞浸潤水平呈負相關(圖5D)。通過免疫組化檢測，乳腺癌組織中NFKBIA蛋白水平與M1、M2和CD8+ T細胞浸潤量的相關性也得到了證實(圖5E, F)。這些結果表明，NFKBIA是NF-κB信號通路的抑制因子，與NFIL3不同，它調控TNBC中腫瘤相關的炎癥反應。

圖5 NFKBIA抑制NF-κB信號通路的活性，并與乳腺癌免疫細胞的浸潤相關

   接下來，通過細胞計數和克隆形成實驗，發現過表達NFKBIA抑制了細胞增殖，而下調NFKBIA則促進了Hs578T細胞(圖6A-D)。NFKBIA的過表達抑制了皮下Hs578T腫瘤的生長(圖6E)，而NFKBIA的下調促進了裸鼠皮下Hs578T腫瘤的生長(圖6F)。此外，過表達NFKBIA不僅在體外抑制Hs578T細胞(圖6G-I)的遷移和侵襲，而且在小鼠尾靜脈注射模型中降低Hs578T細胞的肺轉移(圖6J)。下調NFKBIA基因可促進Hs578T細胞(圖6K-M)在體外的遷移和侵襲，并增強Hs578T細胞在體內的轉移(圖6N)。這些結果表明，NFKBIA與致癌的NFIL3不同，是一種抑制乳腺癌細胞進展的腫瘤抑制因子。

圖6 NFKBIA抑制TNBC細胞的增殖和轉移

6. NFIL3通過抑制NFKBIA促進NF κB的激活和乳腺癌的進展

為了進一步評價NFKBIA在介導NFIL3對NF-κB激活和TNBC進展的影響中的關鍵作用，在Hs578T(圖7A)細胞中過表達NFKBIA和NFIL3，并檢測了NFKBIA和NFIL3過表達對NF-κB活性和乳腺癌細胞株的增殖、遷移和侵襲的影響。在過表達NFIL3的乳腺癌細胞中拯救NFKBIA的表達，可以阻斷Hs578T細胞中NFIL3過表達引發的NF-κB從細胞質到細胞核的快速易位(圖7B)。雙熒光素酶報告實驗證實，挽救NFKBIA的表達抑制了NFIL3對NF-κB活性的促進作用(圖7C)。NFKBIA的表達部分逆轉了NFIL3對Hs578T細胞(圖7D)的增殖促進作用，以及對Hs578T細胞(圖7E, F)的遷移和侵襲促進作用。這些表明NFIL3通過抑制NFKBIA進而增強NF-κB信號通路的活性，從而促進TNBC的進展。

圖7 NFIL3通過抑制NFKBIA，激活NF-κB炎癥通路，促進TNBC細胞的增殖、遷移和侵襲

7. 針對NF-κB活性的抗炎策略阻斷了NFIL3蛋白在TNBC中的致癌作用

雙熒光素酶報告實驗檢測到，阿司匹林和Bay11-7082不僅顯著阻斷了NFIL3蛋白介導的NF-κB信號通路的激活(圖7G)，而且顯著抑制了NFIL3對Hs578T細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用(圖7H-J)。此外，阿司匹林顯著抑制了NFIL3對裸鼠Hs578T細胞生長(圖7K)和轉移(圖7L)的促進作用。綜上所述，針對NF-κB活性的方法可阻斷了NFIL3蛋白在TNBC中的致癌作用。

主要結論：

與正常乳腺組織及其他亞型乳腺癌相比，NFIL3蛋白在TNBC中均升高，并通過抑制NFKBIA的表達，激活NF-κB信號通路，促進TNBC細胞的進展。針對NF-κB活性的抗炎策略阻斷了NFIL3在TNBC中的致癌作用。本研究可能為TNBC的防治提供新的靶點。