結直腸癌（CRC）患者死亡的主要原因是腫瘤轉移。越來越多的證據表明，circRNA在癌癥的起始和發展中發揮著關鍵作用。然而，circRNAs協同癌癥轉移的潛在分子機制仍不明確，需要進一步澄清。因此，目前有研究表明CircHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin通路在促進腫瘤侵襲性中發揮關鍵作用，是疾病的預后生物標志物，證明CircHERC4可作為CRC患者的一個可開發的治療靶點。該研究發表在《Journal of Hematology＆Oncology》，IF: 17.388。

技術路線：

主要研究結果：

1. 結腸癌中circHERC4的識別和特征

作者選擇結腸癌組織和配對的相鄰非腫瘤組織進行RNA序列分析，以獲得CircRNA的表達譜。根據fold change ≥10.0 和P< 0.05，篩選了轉移相關的CircRNA，最后應用transwell侵襲試驗篩選出功能性CircRNA，最終篩選出circHERC4（has_circ_0007113）（圖1a）。通過RNase R和放線菌素D處理后，HERC4 mRNA水平顯著下調，而circHERC4 mRNA水平保持不變(圖1c, d)。此外，通過核質分離后的qRT-PCR，發現circHERC4主要位于細胞質中(圖1e)。

圖1 circHERC4在CRC細胞中的鑒定和表征

2. circHERC4而非HERC4 mRNA的過度表達與結腸癌患者預后不良相關

qRT-PCR檢測120對組織樣本（120個癌組織和120個正常組織）中circHERC4的表達。結果表明，在結腸癌患者中，circHERC4的表達顯著增加（P<0.001）（圖2a）。circHERC4的高表達與淋巴轉移（P<0.01）（圖2b）和遠處轉移（主要是肝轉移）呈正相關（P<0.01）（圖2c）。對具有臨床特征的120例結腸癌患者進行相關分析，發現circHERC4表達與病理分期和組織學分級相關（表1）。circHERC4的過度表達與結腸癌中宿主HERC4mRNA無關（圖2d）。Kaplan-Meier生存分析顯示，circHERC4高表達的患者總體生存率較低（P<0.05）（圖2g）。HERC4 mRNA表達水平與患者預后無關（圖2h）。綜上所述，這些結果表明，circHERC4(而非其宿主HERC4 mRNA)在CRC組織中顯著上調，而更高的circHERC4表達可能意味著預后不良。

圖2 CircHERC4在CRC組織中過表達并與轉移相關

表1 circHERC4低表達和高表達的CRC患者的臨床特點

3. CircHERC4作為一種致癌基因，在體外和體內促進CRC的增殖、遷移和侵襲

為了確定circHERC4的功能作用，檢測了circHERC4在人正常結腸上皮細胞、HCoEpic和CRC細胞(HCT116、DLD-1、HT29、LoVo和SW480)中的表達。結果發現circHERC4在CRC細胞中的表達顯著上調，其中與HCoEpic細胞相比，circHERC4在DLD-1和HCT116細胞中的表達相對較高，而在SW480細胞中的表達相對較低(圖3a)。因此，選擇HCT116、DLD-1和SW480細胞進行進一步研究。首先設計了針對circHERC4剪接序列的siRNAs(圖3b)。DLD-1和HCT116細胞轉染circHERC4 siRNA，其成功沉默circHERC4，但未沉默HERC4 mRNA（圖3c）。根據CCK-8實驗，沉默circHERC4顯著抑制了DLD-1和HCT116細胞的活力(圖3d)。集落形成實驗顯示，與NC相比，circHERC4下調組的DLD-1和HCT116細胞增殖能力也受到抑制(圖3e)。此外，transwell實驗顯示，沉默circHERC4抑制了DLD-1和HCT116細胞的遷移和侵襲能力(圖3f)。過表達circHERC4質粒轉染到SW480細胞中，發現circHERC4明顯增加(圖3g)。結果表明，circHERC4過表達顯著促進了體外CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖3h-j)。

異種移植和轉移小鼠模型也支持circHERC4在體內發揮致癌作用的觀點。干擾circHERC抑制腫瘤的生長速度和腫瘤重量 (圖3k-m)。與陰性對照組相比，sh-circHERC4組肺、肝轉移的發生率顯著降低(圖3n)。HE染色顯示sh-NC組轉移結節面積極高，而sh-circHERC4組轉移結節面積顯著降低(圖3o)。以上數據證實了circHERC4在體外和體內均能促進CRC的進展，特別是轉移。

圖3 CircHERC4作為一種致癌基因，在體外和體內調節增殖、遷移和侵襲

4. CircHERC4在CRC細胞中直接與miR-556-5p結合

在雙熒光素酶報告實驗中，miR-556-5p具有最大的熒光素酶活性抑制作用(圖4a)。RNA pull-down實驗后的qPCR結果顯示，circHERC4 mRNA顯著富集，而宿主HERC4 mRNA則不顯著富集。通過qPCR檢測circHERC4 pull-down部分中所有具有熒光素酶活性抑制作用的7個miRNA。circHERC4 pull-down部分中miR-556-5p的富集顯著高于NC組和其他miRNAs(圖4b)。這些結果提示miR-556-5p直接與circHERC4結合，并可能參與了circHERC4在CRC中的功能。

圖4 CircHERC4通過與miR-556-5p相互作用促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲

5. 抑制miR-5565p可介導circHERC4的致癌功能，激活CRC中的Notch信號通路

qPCR檢測證實了miR-556-5p在CRC組織中下調(圖4c)，miR-556-5p在有淋巴轉移(圖4d)或遠處轉移(圖4e)患者中的表達水平要低得多。淋巴結轉移陽性的患者miR-556-5p水平較低，而其他特征與miR-556-5p的表達無顯著相關性(表2)。miR-556-5p能顯著抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖4f-h)。拯救實驗中miR-556-5p模擬物可以部分恢復過表達circHERC4增強的SW480細胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖4i-k)。綜上所示，這些結果提供了證據，表明miR-556-5p具有抗癌作用，并通過直接結合CRC部分介導circHERC4的致癌功能。

根據維恩圖(圖5a)，篩選出了9109個在circHERC4沉默和miR-556-5p過表達的DLD-1細胞中顯著改變的轉錄本。KEGG通路富集分析顯示，這9109個轉錄本富集在許多腫瘤相關信號通路中，尤其是與結腸癌發生相關的Notch信號通路(圖5b)。因此， circHERC4可能通過激活Notch信號通路促進細胞轉移，而Notch信號通路可能被miR-556-5p阻斷。

圖5 CTBP2是miR-556-5p的靶基因

6. CTBP2是miR-556-5p的靶點，通過抑制E-cadherin在結直腸癌中的表達而發揮致癌作用

熱圖顯示Notch信號通路中大部分基因通過沉默circHERC4和過表達miR-556-5p而下調(圖5c)。結合生物信息學分析，CTBP2被預測為miR-556-5p的靶點(圖5d)。熒光素酶報告實驗表明miR-556-5p的過表達顯著降低了包括CTBP2野生型結合位點而不包括突變型結合位點的載體的熒光素酶活性(圖5d)。Western blot實驗證明，miR-556-5p可以顯著抑制CTBP2的蛋白水平，但卻挽救了CTBP2靶向E-cadherin的表達(圖5e)。

GEPIA數據庫和免疫組化試驗發現CTBP2蛋白在結直腸癌組織中表達水平較癌旁正常組織上調(圖6a,b)。Kaplan Meier生存分析評估CTBP2高表達與CRC患者較低的生存概率顯著相關(圖6c)。敲除CTBP2促進E-cadherin蛋白表達水平下降(圖6d)。與NC相比，沉默CTBP2顯著抑制了細胞增殖 (圖6e-g)，這些結果為CTBP2是miR-556-5p的靶基因，其過表達通過抑制E-cadherin介導CRC腫瘤轉移提供了重要的認識。

圖6 CTBP2在CRC組織中過表達，可促進CRC細胞的進展

7. 沉默CTBP2可以消除過度表達circHERC4所引起的效應

當circHERC4被敲低時，CTBP2蛋白水平顯著下降。相反，CTBP2的下游靶蛋白E-cadherin在這些條件下顯著增加(圖6h)，Ki-67在circHERC4沉默后急劇下調(圖6i)。挽救實驗來研究circHERC4和CTBP2之間的功能相互作用。與轉染空載體或siNC模擬物的SW480細胞相比，轉染CTBP2 siRNA模擬物的過表達circHERC4細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯下降(圖6j-l)，circHERC4的致癌功能可以通過消除CTBP2的表達而部分逆轉。Western blotting結果顯示，CTBP2可以部分恢復circHERC4對E-cadherin表達的影響(圖6m)。circHERC4和CTBP2在高級別CRC組織中過表達，而miR-556-5p在低級別CRC組織中更豐富(圖7a)。異種皮下移植的結果表明，circHERC4過表達可加速腫瘤生長，注射CTBP2 siRNA或miR-556-5p mimic后，這種作用可被抑制(圖7b-d)。免疫組化實驗表明，沉默CTBP2或過表達miR-556-5p來部分挽救circHERC4對CTBP2 和Ki67促進、E-cadherin抑制的作用。在尾靜脈注射小鼠模型中，上調circHERC4可促進肺和肝臟轉移性結節的形成，當CTBP2下調或miR-556-5p上調時，circHERC4誘導的致癌作用被阻斷(圖7f-g)?？偟膩碚f，這些結果證明CTBP2可以促進CRC的進展，并且在體內和體外都受到circHERC4/miR-556-5p軸的調控。

圖7 CTBP2受circHERC4/miR-556-5p相互作用的調控

研究結論：

綜上所述，該報告發現了一個之前未被發現的致癌驅動因子circHERC4在CRC組織中升高，并與CRC的增殖、遷移和侵襲相關。此外，circHERC4在CRC患者中的高表達與轉移和較差的生存率呈正相關。作者提出了circHERC4可以阻斷miR-556-5p對CTBP2的抑制活性的機制。因此，沉默circHERC4可以下調CTBP2的表達，并伴隨E-cadherin的激活。該研究結果表明，circHERC4可能是一種潛在的預后生物標志物，沉默circHERC4為CRC治療提供了一個新的治療靶點(圖8)。

圖8 circHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin信號通路促進CRC發病和轉移的機制示意圖

參考文獻：
He J, Chu Z, Lai W, et al. Circular RNA circHERC4 as a novel oncogenic driver to promote tumor metastasis via the miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin axis in colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021; 14(1):194.