腫瘤干細胞(Cancer stem cells, CSC)是目前臨床腫瘤治療的主要障礙。外泌體是一種包含circRNAs的囊泡，參與細胞與細胞之間的通信。然而，乳腺CSC (BCSC)外泌體的作用仍不清楚，本研究的目的是研究BCSC外泌體中的circRNAs對乳腺癌細胞代謝的重編程。circCARM1在BCSC外泌體中的含量高于親本乳腺癌細胞中的含量。進一步研究表明，BCSC外泌體circARM1通過miR-1252-5p/PFKFB2在乳腺癌細胞糖酵解過程中發揮重要作用。綜上所述，BCSC外泌體來源的circARM1通過海綿吸附miR-1252-5p調控PFKFB2的表達，在乳腺癌細胞糖酵解過程中發揮重要作用。本文于2022年1月發表于Oncogene（IF=9.867）上。

技術路線

結果

1）BCSC外泌體介導乳腺癌細胞糖酵解

為了研究BCSC對乳腺癌細胞功能的影響，我們采用微球形成法擴增BCSC。MDA-231細胞在低附著板的干細胞培養基中培養(圖1a)。使用乳腺球分析干細胞特征，發現干細胞標記物CD44、SOX2、OCT4和ALDH1A1在CSC中在轉錄和轉錄后水平上的表達水平較高(圖1b、c)。為了探索BCSC外泌體在調節癌癥細胞功能中的作用，我們制備并觀察了來自乳腺癌細胞球(S-exo)或其親本細胞(P-exo)的外泌體(圖1d)。外泌體標記物進行免疫印跡分析(圖1e)。當用S-exo或P-exo處理MDA-231細胞時，S-exo處理的細胞比P-exo處理的細胞顯示出更多的生存能力(圖1f)。為了探索CSC外泌體在調節腫瘤糖酵解和糖酵解能力中的作用，我們使用S-exo或P-exo處理乳腺癌細胞，S-exo處理的細胞比P-exo處理的細胞表現出更高的細胞外酸化率(ECAR)(圖1g, h)。經S-exo處理的MDA-231細胞表現出較低的耗氧率(OCR)，表明線粒體呼吸受到抑制，ATP生成顯著減少(圖1i, j)。此外，S-exo培養的癌細胞有較高的糖酵解酶的表達，包括GLUT1、HK2、丙酮酸激酶同工酶M2 (PKM2)、3-磷酸肌醇依賴激酶1 (PDK1)和LDHA(圖1k)。這些數據表明CSC-exo增加了癌細胞的有氧糖酵解。

2）BCSC外泌體的circRNA譜

為了研究來自CSC外泌體的circRNA對乳腺癌細胞表型影響，我們制備了S-exo和P-exo來進行circRNA陣列分析。熱圖顯示上調和下調的circRNA有兩倍以上的折疊(圖2a)。外泌體中最豐富的circRNA長度為200-800 bp(圖2b)。circRNA資源顯示，78%的circRNA來自外顯子(圖2c)。在乳腺癌細胞和MCF10A細胞中檢測circCARM1的表達，MDA-231、MDA-468、BT549細胞中circCARM1的表達高于其他細胞株(圖2d)。circCARM1水平在CSC外泌體中比在P-exo中顯著上調(圖2e)。檢測乳腺癌組織中circCARM1的表達，結果顯示65例乳腺癌組織中circCARM1的表達高于癌旁正常組織。circCARM1在乳腺中的平均表達水平較高(圖2f))。FISH檢測證實乳腺癌組織中circCARM1表達水平高于癌旁正常組織(圖2g)。為了進一步確認乳腺癌組織外泌體中circCARM1的水平，我們將新鮮的乳腺癌組織制備成球狀以獲得外泌體，并收集外泌體(圖2h)，如圖2i所示。結果顯示，乳腺癌球形體的外泌體中circCARM1的含量高于相鄰正常組織的外泌體(圖2j)。結果表明，circCARM1在組織和細胞S-exo中富集，可能在乳腺癌中作為癌基因發揮作用。

3）circCARM1的環狀RNA結構的鑒定及臨床特征

CircCARM1 (circ_0004552)源于CARM1基因，該基因位于第3染色體(chr3:157839891-157841780)，由基因組長度4257 bp的外顯子2、3和4的頭尾剪接組成(圖3a)。對MDA -231和MDA-468細胞中circCARM1在細胞質或細胞核中的豐度進行qRT-PCR分析，發現circCARM1主要位于細胞質中(圖3b)。乳腺癌細胞中circCARM1的FISH分析顯示，circCARM1存在于細胞質中(圖3c)。為了研究circCARM1是否對RNase R有反應，我們在MDA-231和BT549細胞中對總RNA進行預消化，對RNase R處理后的circCARM1和CARM1 RNA進行qRT-PCR分析，結果表明circCARM1對RNase R有抗性(圖3 d)。為了了解circCARM1和CARM1的RNA穩定性，我們用轉錄抑制劑放線菌素Dat處理細胞，數據顯示circCARM1轉錄物相對于CARM1 mRNA是穩定的(圖3e, f)。

4）來自BCSC外泌體的circCARM1增加了乳腺癌細胞的有氧糖酵解

為了了解來自BCSC外泌體的circCARM1在癌細胞中的作用，circCARM1被慢病毒介導的shRNA敲除(圖4a)。在細胞中下調circCARM1后，乳腺癌細胞生存能力受到抑制(圖4b)。流式細胞術分析顯示，circCARM1下調介導細胞周期相位分布(圖4c)。將circCARM1下調的S-exo和P-exo與乳腺癌細胞共培養，評估糖酵解作用。數據表明，通過S-exo處理，ECAR降低(圖4d)。在S-exo存在和circCARM1下調的情況下，癌細胞的糖酵解和糖酵解能力被抑制(圖4e)。在MDA-468細胞中也有類似的結果(圖4f, g)。與P-exo處理的細胞相比，S-exo處理的癌細胞表現出更低的OCR(圖4h)、ATP生成和最大呼吸(圖4i)，然而，抑制外泌體circCARM1則逆轉這一結果。在MDA-468細胞中也有類似的結果(圖4j, k)。通過實時RT-PCR(圖4l, m)和western blotting(圖4n)，我們還發現糖相關基因在具有circCARM1下調的外泌體的MDA-231和MDA-468細胞中被下調。這些數據表明circCARM1參與了癌細胞糖酵解。

5）EIF4A3調控乳腺癌細胞中circCARM1的表達

為了探究circCARM1的生物發生，circRNA相互作用(https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html)顯示，在circCARM1 pre-mRNA的上游和下游，EIF4A3有5個結合位點(圖5a)。采用RIP驗證EIF4A3能通過抗EIF4A3抗體通過這些假定的結合位點與CARM1 pre-mRNA結合(圖5b)。此外，qRT-PCR檢測顯示，過表達EIF4A3促進了circCARM1的表達，而下調EIF4A3則抑制了乳腺癌細胞中circCARM1的表達(圖5c, d)。western blot分析顯示，在乳腺癌細胞中，敲除circCARM1可以抑制糖酵解相關蛋白的表達，而這種影響可以通過共轉染EIF4A3表達載體來逆轉(圖5e)。臨床上，EIF4A3與乳腺癌組織中circCARM1的表達呈正相關(圖5f)。這些數據支持了EIF4A3促進circCARM1的生物發生。

6）乳腺癌細胞中circCARM1與miR-1252-5p結合

CircInteractome (CircInteractome .nia.nih.gov)預測了circCARM1和miRNA的相互作用，其中一個潛在的miRNA為miR-1252-5p，并顯示了結合位點(圖6a)。為了研究潛在的靶miRNA，我們設計了一個生物素化的circCARM1探針，該探針被證實可以拉下癌細胞中的miRNA, miR-1252-5p在乳腺癌細胞中被circCARM1探針大量拉下(圖6 b, c)。通過生物素化的miR-1252-5p探針，證實circARM1在MDA-231和MDA-468細胞中被miR-1252-5p拉下(圖6d)。通過熒光素酶報告基因檢測，miR-12525p過表達顯著降低了轉染含有完整circCARM1序列的載體的細胞的熒光素酶活性(圖6e)。FISH研究顯示，circCARM1和miR-1252-5p共定位于乳腺癌細胞的細胞質中(圖6f)。乳腺癌組織中miR-1252-5p顯著下調(圖6g)。Pearson相關分析顯示，在乳腺癌組織中miR-1252-5p與circCARM1的表達呈負相關(圖6h)。

7）circCARM1通過miR-1252-5p調控PFKFB2在乳腺癌細胞中的表達

我們使用目標預測引擎(包括targescan、miRanda和miRWalk)識別候選目標(圖7a)。其中，我們選擇了10個在乳腺癌中表現出顯著表達失調的基因進行進一步研究。實時熒光定量PCR證實PFKFB2在乳腺癌組織中較正常癌旁組織表達上調(圖7b)。數據與TCGA數據一致(圖7c)。通過異位表達circCARM1可以增加PFKFB2的表達(圖7d)，通過抑制circCARM1的表達可以降低PFKFB2的表達(圖7e)。為了證實miR-1252-5p調控PFKFB2，我們構建了一個基于熒光素酶的報告基因質粒。用miR-1252-5p模擬物和報告質粒共轉染細胞可顯著降低PFKFB2的熒光素酶活性(圖7f)。在miRNA-1252-5p過表達的乳腺癌細胞株中，PFKFB2顯著降低(圖7g)。PFKFB2通過過表達circCARM1恢復(圖7h)。相反，過表達miR-1252-5p后PFKFB2表達下調，circCARM1可部分恢復下調(圖7i)。Pearson相關分析顯示circCARM1和PFKFB2在乳腺癌標本中的表達呈正相關(圖7j)。乳腺癌標本中miR-1252-5p和PFKFB2的表達呈負相關(圖7k)。這些結果表明PFKFB2是miR-1252-5p的靶基因，在乳腺癌細胞中受到circCARM1的調控。

8）PFKFB2部分挽救了外泌體circCARM1對癌細胞糖酵解的影響

為了解circCARM1在PFKFB2調控的乳腺癌細胞糖酵解中的作用，乳腺癌細胞外泌體中下調circCARM1或過表達PFKFB2。干擾circCARM1后，細胞生存能力被抑制，PFKFB2可以挽救這種進展 (圖8a,b)。細胞集落形成也用于驗證結果(圖8 c, d)。circCARM1的下調降低ECAR，PFKFB2可以挽救MDA-468和MDA-231細胞ECAR的下降(圖8e-h)。經S-exo處理的癌細胞顯示出較低的OCR，PFKFB2可以挽救經S-exo/CARM1處理的細胞中OCR的上調(圖8i, j)。與對照組相比，缺氧條件下circCARM1過表達導致基底OCR明顯降低，最大OCR顯著降低。相反，在缺氧條件下，circCARM1的下調導致了基底和最高水平的OCR升高。在另一個細胞株BT549中，結果是一致的(圖8k, l)。通過western blotting檢測，circCARM1和PFKFB2過表達后，GLUT1、HK2、PKM2等糖酵解標志物增強(圖8m)。因此，我們認為來自乳腺癌細胞外泌體的circCARM1增強了PFKFB2調控的細胞糖酵解作用。

9）circCARM1在乳腺癌體內的生物學意義

為了進一步證實來自CSC外泌體的circCARM1在體內促進乳腺癌的作用，我們建立了Balb/c裸鼠乳腺癌原位模型。使用MDA-231細胞與來自circCARM1下調的親本細胞的CSC外泌體建立模型(圖9a)。生長曲線如圖9b所示。實時成像顯示，circCARM1 shRNA組的平均腫瘤大小遠小于sh-NC組(圖9c)。S-exo/circCARM1 shRNA組腫瘤的重量比sh-NC組輕(圖9d)。我們對小鼠血清中的circCARM1水平進行了評估，發現在S-exo處理的小鼠中circCARM1升高，而在circCARM1下調的小鼠中circCARM1降低(圖9e)。將切除的腫瘤進行石蠟包埋切片，檢測Ki67、PFKFB2。S-exo/ circCARM1 shRNA小鼠的Ki67、CD44、HK2、PFKFB2和LDHA水平低于對照組(圖9f)。結果還顯示，在S-exo/circCARM1 shRNA處理的小鼠組織中，PFKFB2的表達被抑制，LDHA和HK2也被下調(圖9g)。結果表明circCARM1在促進乳腺癌生長中發揮了重要作用。

結論：該研究表明，乳腺癌細胞或新鮮組織的球狀體中的外泌體中circCARM1上調。circCARM1可以作為miR-1252-5p的海綿，在乳腺癌細胞中調節PFKFB2的表達，參與乳腺癌糖酵解。

參考文獻：Liu Y, Ma L, Hua F, Min Z, Zhan Y, Zhang W, Yao J. Exosomal circCARM1 from spheroids reprograms cell metabolism by regulating PFKFB2 in breast cancer. Oncogene. 2022 Jan 13. doi: 10.1038/s41388-021-02061-4. Epub ahead of print. PMID: 35027669.