細(xì)胞衰老是一種以增殖細(xì)胞停止、分泌表型、大分子損傷和代謝改變?yōu)樘卣鞯募?xì)胞狀態(tài)，可由幾種不同的應(yīng)激機(jī)制觸發(fā)。本研究中，作者探討caspase-4非典型炎癥小體對細(xì)胞衰老的影響。這篇文章于2021年12月發(fā)表于《springer nature》，IF=10.717

本文技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1．在人二倍體成纖維細(xì)胞中，caspase-4識別的細(xì)胞質(zhì)脂多糖誘導(dǎo)了衰老反應(yīng)

雖然典型的炎癥小體可以被微生物來源的胞壁酰二肽(MDP) 激活，但半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase-4和caspase-5作為非典型炎癥小體能識別微生物脂多糖（LPS）誘導(dǎo)Gasdermin-D裂解和焦亡。Gasdermin-D是非典型炎癥小體的功能底物，可誘導(dǎo)IL-1β分泌和細(xì)胞凋亡。為了比較激活典型和非典型炎癥小體在衰老中的作用，作者在人IMR90成纖維細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染MDP或LPS激活caspase-1或caspase-4/5炎癥小體。為了研究caspase對LPS轉(zhuǎn)染后的衰老表型的影響，作者在轉(zhuǎn)染前用shRNA下調(diào)caspase-1或caspase-4的表達(dá)(圖1A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與caspase-1相比，caspase-4在獲得衰老特征方面是必需的，能增加SA-β-半乳糖苷酶活性增加，減低細(xì)胞增殖速度，并且能在存活細(xì)胞亞群和死亡細(xì)胞中誘導(dǎo)p21CIP1和p16INK4a(圖1B-D)。此外，在存在LPS的條件下，caspase-4過表達(dá)加速了衰老(Fig. 1E, F)。說明CASPASE-4的表達(dá)對非典型炎癥小體誘導(dǎo)的衰老至關(guān)重要，細(xì)胞內(nèi)LPS暴露后的衰老表型的獲得是通過caspase-4介導(dǎo)的，且呈劑量依賴性。

接下來，作者研究caspase-4的底物gasdermin-D和關(guān)鍵的衰老調(diào)節(jié)因子p53在LPS誘導(dǎo)的衰老和焦亡中的作用。GSDMD是炎性caspase的共同底物，P53的敲低（TP53）和GSDMD的敲低顯著降低了LPS依賴的細(xì)胞生長停滯 (圖1H, I, J)。有趣的是，在LPS誘導(dǎo)的衰老中，GSDMD的抑制也對p16INK4a和CASPASE-4誘導(dǎo)有強(qiáng)烈的影響?？傊?，這些結(jié)果表明，非典型炎癥小體的細(xì)胞質(zhì)LPS感應(yīng)誘導(dǎo)了一種依賴于caspase-4、gasdermin-D和p53表達(dá)的衰老反應(yīng)。

Fig1 LPS介導(dǎo)的caspase-4活化誘導(dǎo)人原代成纖維細(xì)胞衰老表型

2. Caspase-4介導(dǎo)的LPS誘導(dǎo)的衰老反應(yīng)與IL-1β啟動無關(guān)

炎癥小體的激活受到兩種機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控。首先需要提高IL1B的轉(zhuǎn)錄水平，之后是第二個誘導(dǎo)炎性小體組裝的信號。有趣的是，IMR90成纖維細(xì)胞中唯一過表達(dá)CASPASE-4或CASPASE-1的衰老誘導(dǎo)并沒有誘導(dǎo)IL1B的轉(zhuǎn)錄激活(Fig. 2A)。相反，IL1B轉(zhuǎn)錄水平在LPS轉(zhuǎn)染后以CASPASE-4依賴的方式增加(Fig. 2B)。

作者之前已經(jīng)證明TLR2在細(xì)胞衰老中控制IL1B表達(dá)和衰老相關(guān)的分泌表型SASP的作用。因此，作者決定研究TLR2介導(dǎo)的炎性小體啟動是否與LPS介導(dǎo)的CASPASE-4誘導(dǎo)的衰老協(xié)同作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，合成脂肽Pam2CSK4和Pam3CSK4(分別為LR2/6和TLR 2 /2激動劑) 的加入，而非LPS (TLR4激動劑)和MDP高度誘導(dǎo)了IL1B mRNA。然后，作者觀察到用TLR2受體激動劑Pam2CKS4啟動炎癥小體與LPS轉(zhuǎn)染顯著協(xié)同產(chǎn)生IL-1β誘導(dǎo)，而CASPASE-4異位過表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了這種誘導(dǎo)(Fig. 2C)。然而，添加Pam2CKS4，LPS誘導(dǎo)的衰老中，作者沒有觀察到細(xì)胞增殖或SA-β-半乳糖苷酶活性顯著下降(Fig. 2D, E)。通過觀察對數(shù)增長，在所有條件下，LPS轉(zhuǎn)染細(xì)胞中觀察到的IL1B mRNA水平的增加都是最小的Fig. 2C)。這些結(jié)果表明，CASPASE-4刺激的附加信號，如持續(xù)啟動信號對IL1B和SASP在LPS介導(dǎo)的細(xì)胞衰老中的誘導(dǎo)。此外，這些數(shù)據(jù)也表明LPS誘導(dǎo)的caspase-4衰老反應(yīng)是獨(dú)立于IL1B和SASP的。

Fig2 LPS介導(dǎo)的caspase-4誘導(dǎo)的衰老與炎性小體啟動無關(guān)

3. Caspase-4蛋白水解活性對LPS誘導(dǎo)的衰老不是必需的

Caspase-4的活性位點(diǎn)已經(jīng)被鑒定為與殘基C258相關(guān)，該氨基酸的點(diǎn)突變使該蛋白催化失活。為了進(jìn)一步研究Caspase-4蛋白酶的酶活對衰老的影響，作者在IMR90細(xì)胞中過表達(dá)CASPASE-4野生型和催化死亡的突變體C258A (CASPASE-4C258A) (Fig. 3A), 并對表型結(jié)果進(jìn)行評估。過表達(dá)野生型caspase-4或caspase-4C258A可使細(xì)胞增殖降低，SA-β-半乳糖苷酶活性增加(Fig. 3B, C)。接下來，在LPS轉(zhuǎn)染前，在IMR90成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)野生型caspase-4和caspase-4C258A (Fig. 3D)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)caspase-4C258A而非野生型caspase-4的 IMR90細(xì)胞對LPS轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞死亡具有耐藥性(Fig. 3E)。表明CASPASE-4野缺陷形式在焦亡中具有負(fù)作用。然而，CASPASE-4野生型和CASPASE-4C258A過表達(dá)的細(xì)胞在LPS刺激后仍然對衰老特征敏感(Fig. 3F, G)。這些結(jié)果表明，與caspase-4介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相反，caspase-4在在脂多糖誘導(dǎo)的衰老與caspase-4催化活性無關(guān)。

Fig 3 Caspase-4介導(dǎo)的衰老調(diào)控獨(dú)立于其催化功能

4.Caspase-4在癌基因誘導(dǎo)的衰老過程中被誘導(dǎo)和組裝

接下來，作者研究了caspases在癌基因誘導(dǎo)衰老中(OIS)的作用。為誘導(dǎo)OIS，在IMR90人成纖維細(xì)胞中過表達(dá)RASG12V。HRASG12V過表達(dá)降低細(xì)胞增殖，增加SA-β-半乳糖苷酶活性(Fig. 4A)。與細(xì)胞周期抑制劑p21CIP1、p16INK4a和p15INK4b的上調(diào)相一致，RASG12V過表達(dá)后，Caspase-4在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均增加(Fig. 4B, C)。接下來，作者利用誘導(dǎo)系統(tǒng)來嚴(yán)格控制衰老進(jìn)程。在這個系統(tǒng)中，雌激素受體(ER)配體結(jié)合域的突變體與感興趣蛋白(RAS)融合;結(jié)果發(fā)現(xiàn)ER:RAS細(xì)胞在添加4-羥他莫西芬(4OHT)后發(fā)生致癌基因誘導(dǎo)衰老(Fig. 4D)。與未處理的IMR90 ER:RAS相比，加入4OHT后，IMR90 ER:RAS細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞增殖停滯，SA-β-半乳糖苷酶活性增加(Fig. 4D)。在OIS處理的細(xì)胞中，caspase-4 mRNA水平、IL1B mRNA水平、以及Caspase-4蛋白表達(dá)呈指數(shù)增長 (Fig. 4E, F,G)。此外，內(nèi)源性caspase-4寡聚化在IMR90 ER:RAS衰老細(xì)胞中檢測到，但在4OHT處理后3天的對照組細(xì)胞中未檢測到(Fig. 4H)。此外，加入4OHT之后的第4天和第8天，IMR90 ER:RAS細(xì)胞中caspase-4蛋白水解活性也有所提高(Fig. 4I)。這些結(jié)果表明，在OIS中，caspase-4的表達(dá)被誘導(dǎo)，非典型炎癥小體被組裝。

圖4 Caspase-4非典型炎癥小體在癌基因誘導(dǎo)的衰老中被激活

5.在OIS中，Caspase-4非典型炎癥小體是炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的

接下來，作者用IMR90 ER: RAS系統(tǒng)研究了caspase-4在OIS中的功能作用，分析CASPASE-4缺失后mRNA表達(dá)的整體變化。IMR90 ER:stop和ER: RAS 細(xì)胞轉(zhuǎn)染CASPASE-4和CASPASE-4 干擾序列，5天后和8天后采集樣本，在caspase-4激活和SASP完全形成后立即加入4OHT，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析(Fig. 5A)。轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)有557個和478個基因顯著差異表達(dá)，RASG12V-OIS 細(xì)胞中添加OHT添加的第5天和第8天分別有340個和240個CASPASE-4依賴方式誘導(dǎo)的基因(Fig. 5A)。對50個標(biāo)志性基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析(GSEA)，結(jié)果顯示RASG12V-OIS細(xì)胞CASPASE-4依賴調(diào)控與炎癥過程相關(guān)，包括TNF-α信號和干擾素反應(yīng)。熱圖顯示，如果靶向CASP4(包括SASP因子)，那么衰老過程中炎癥相關(guān)基因的增加表達(dá)會被消除(Fig. 5C-E)。血清淀粉樣蛋白SAA1和SAA2屬于載脂蛋白家族，能激活先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，最近被確認(rèn)為SASP因子。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)CASPASE-4成為OIS的靶點(diǎn)時(shí)，SAA1和SAA2的表達(dá)也降低了(Fig. 5F, G)。此外，當(dāng)CASPASE-1或CASPASE-4被靶向時(shí)，細(xì)胞內(nèi)成熟IL-1β的水平也顯著降低(Fig. 5H, I, J)。在RASG12V誘導(dǎo)的細(xì)胞中，當(dāng)CASPASE-4靶向時(shí)，分泌的IL-1β濃度顯著降低(Fig. 5K)。此外，通過抑制CASPASE-4的表達(dá)，OIS中IL1B、IL6和IL8 mRNA的誘導(dǎo)也受到了影響 (Fig. 5L)。這些結(jié)果表明caspase-4參與了caspase-1介導(dǎo)的OIS中SASP的激活。

Fig 5 Caspase-4激活控制促炎SASP

6.在OIS中，caspase-4非典型炎癥小體有助于抑制細(xì)胞增殖

為了研究非典型炎癥小體在OIS中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中的作用，作者對 CASPASE-4進(jìn)行干擾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-4靶向siRNA轉(zhuǎn)染顯著挽救了OIS期間的早期細(xì)胞增殖停滯(Fig. 6A)，增加了總細(xì)胞含量(Fig. 6B, C)。事實(shí)上，靶向CASPASE-4降低了p16INK4a的表達(dá)，挽救了pRb的磷酸化(Fig. 6E)，并導(dǎo)致E2F靶基因水平的轉(zhuǎn)錄增加(Fig. 6E), 這表明在OIS中CASPASE-4是通過控制p16INK4a和p15INK4b的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖?？傊珻ASPASE-有助于阻止細(xì)胞衰老過程中的增殖，最終影響pRb的磷酸化狀態(tài)，從而導(dǎo)致E2F靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。

Fig6 在OIS中，Caspase-4有助于抑制細(xì)胞增殖

7.在體內(nèi)， Caspase-11細(xì)胞衰老過程中被誘導(dǎo)

作者已經(jīng)證明caspase-4表達(dá)水平在細(xì)胞衰老中尤為關(guān)鍵。為了研究非典型炎癥小體在體內(nèi)衰老中的表達(dá)，作者使用了三種特征良好的小鼠衰老模型。作者首先在一個OIS模型中分析了caspase-4小鼠同源caspase-11的表達(dá)，該模型由Pdx-CRE誘導(dǎo)表達(dá)小鼠胰腺胰上皮內(nèi)瘤變(PanIN) (Fig. 7A)。作者觀察到與周圍胰腺腺泡細(xì)胞、高級別、野生型小鼠導(dǎo)管和腺泡細(xì)胞相比，低檔PanINs顯示caspase-11染色陽性(Fig. 7A)。重要的是，PanINs中Ki-67染色定量顯示，caspase-11的表達(dá)局限于早期增生指數(shù)低的衰老病灶(Fig. 7B)，這表明caspase-11的表達(dá)與PanIN病變的低級別細(xì)胞增殖低相關(guān)。然后，作者研究了caspase-11在兩種與體內(nèi)衰老相關(guān)的細(xì)胞衰老模型中的表達(dá)。首先，作者通過敲除NF-κ b調(diào)控因子nfkb1-/- (p50-/-)，構(gòu)建NF-κ b結(jié)構(gòu)激活的加速衰老的小鼠模型，該模型顯示了包括肺在內(nèi)的不同組織的衰老。在這個模型中，脂褐素積累已被證明與衰老有關(guān)，并且與野生型小鼠相比，nfkb1-/-在肺中脂褐素積累增加(Fig. 7C)。在caspase-11表達(dá)的細(xì)胞中也檢測到脂褐素積累的類似增加(Fig. 7C)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了在野生型和nfkb1-/-小鼠中小氣道上皮細(xì)胞中p21和caspase-11的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)caspase-11與小鼠加速衰老模型中的衰老標(biāo)記物相關(guān)(Fig.7D)。

然后，作者研究了caspase-11在小鼠自然機(jī)體衰老過程中肺泡細(xì)胞衰老中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)老年小鼠(24月齡)肺泡細(xì)胞數(shù)量端粒相關(guān)DNA損傷反應(yīng)(DDR)病灶(TAFs)增加(Fig.7E), 這是組織中衰老細(xì)胞積累的標(biāo)志，作者發(fā)現(xiàn)這與caspase-11的增加同時(shí)發(fā)生(Fig.7F)。總之，這些結(jié)果驗(yàn)證了非典型炎癥小體促進(jìn)體內(nèi)衰老的模型。

Fig7 Caspase-11在體內(nèi)衰老過程中被誘導(dǎo)表達(dá)

本研究中，作者表明細(xì)胞衰老是由非典型炎癥小體的胞質(zhì)LPS識別誘導(dǎo)的，并且這一途徑在細(xì)胞對致癌應(yīng)激的反應(yīng)中是保守的。

參考文獻(xiàn)：

Fernández-Duran I, Quintanilla A, Tarrats N, Birch J, Hari P, Millar FR, Lagnado AB, Smer-Barreto V, Muir M, Brunton VG, Passos JF, Acosta JC. Cytoplasmic innate immune sensing by the caspase-4 non-canonical inflammasome promotes cellular senescence. Cell Death Differ. 2021 Dec 16. doi: 10.1038/s41418-021-00917-6. Epub ahead of print. PMID: 34916628.