轉(zhuǎn)移是食管鱗狀細胞癌(ESCC)患者死亡的主要原因。盡管越來越多的研究表明G3BP2參與了幾種人類癌癥，但G3BP2如何與長鏈非編碼RNA相互作用并調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄在介導(dǎo)ESCC轉(zhuǎn)移中仍不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)G3BP2在ESCC中表達上調(diào)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，G3BP2表達上調(diào)與ESCC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度及不良預(yù)后顯著相關(guān)。體外和體內(nèi)功能測試均表明，G3BP2顯著增強ESCC細胞的遷移和侵襲能力。在機制上，LINC01554通過泛素化保護G3BP2免于降解來維持G3BP2在ESCC中的高表達，并確定了LINC01554和G3BP2之間的相互作用域。此外，RNA-seq顯示HDGF受G3BP2調(diào)控。G3BP2與HDGF mRNA轉(zhuǎn)錄本結(jié)合以穩(wěn)定其表達。異位表達HDGF可有效消除G3BP2消耗介導(dǎo)的腫瘤細胞遷移抑制作用。有趣的是，引入可抑制G3BP2的化合物C108可顯著抑制體外和體內(nèi)ESCC細胞的轉(zhuǎn)移。總之，本研究描述了一個新發(fā)現(xiàn)的促進食管鱗癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控軸LINC01554/G3BP2/HDGF，并將為食管鱗癌提供新的治療策略。本文于2021年11月發(fā)表于“Oncogene”（IF=9.867）。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）在ESCC患者中，G3BP2的上調(diào)與不良預(yù)后相關(guān)

為了研究G3BP2在ESCC中的表達狀態(tài)，我們首先對Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫進行大數(shù)據(jù)挖掘。這兩個數(shù)據(jù)庫表明G3BP2高表達ESCC(圖1A)，這進一步在SYSUCC隊列證實mRNA水平(圖1 B)。Western blot也檢測到G3BP2在ESCC細胞中的表達升高(圖1C)。為了探討G3BP2在ESCC中表達上調(diào)的臨床意義，我們通過免疫組化染色研究了包含183個原發(fā)性ESCC和93對非腫瘤組織的組織芯片(圖1D)。結(jié)果顯示G3BP2在ESCC組織中高表達(圖1E)。此外，G3BP2高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖1F)和腫瘤浸潤深度(圖1G)顯著相關(guān)。KaplanMeier分析顯示，G3BP2高表達導(dǎo)致ESCC患者總生存期較差(圖1H)。所有這些數(shù)據(jù)都說明了G3BP2高表達水平與ESCC進展之間的相關(guān)性。

2）LINC01554保護G3BP2免受泛素蛋白酶體降解

根據(jù)G3BP2的結(jié)構(gòu)特征，我們探究其是否與非編碼RNA相互作用。catRAPID和RPI-seq平臺均強烈提示G3BP2和LINC01554之間存在相互作用的可能性(圖2A, B)。RNA FISH-IF檢測結(jié)果顯示，G3BP2和LINC01554共定位于細胞質(zhì)中(圖2C)。RIP檢測結(jié)果顯示，G3BP2能特異地沉淀LINC01554(圖2D)。RNA下拉實驗進一步表明，LINC01554探針(而非其反義探針)顯著拉下G3BP2蛋白(圖2E)。接下來，我們研究了LINC01554是否調(diào)控了G3BP2的表達。在LINC01554轉(zhuǎn)染的KYSE30和KYSE150細胞中檢測到G3BP2的RNA和蛋白，我們發(fā)現(xiàn)在LINC01554轉(zhuǎn)染后，G3BP2在蛋白水平上增加，而在RNA水平上沒有增加(圖2F)。另外，在LINC01554轉(zhuǎn)染的細胞中，G3BP2蛋白的半衰期明顯延長(圖2G，左圖)。為了檢驗G3BP2的降解是否通過泛素介導(dǎo)的蛋白酶體系統(tǒng)發(fā)生，我們進行了體外泛素化實驗，發(fā)現(xiàn)LINC01554降低了G3BP2泛素化水平(圖2G，右圖)。因此，這些數(shù)據(jù)表明LINC01554與G3BP2相互作用，并保護其免受泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白降解。

為了證實G3BP2的RRM域與LINC01554的相互作用，我們建立了RRM域缺失的G3BP2突變體。RIP(圖2H)和RNA pull-down檢測(圖2I)的結(jié)果表明，G3BP2的RRM結(jié)構(gòu)域確實與LINC01554結(jié)合。RRM結(jié)構(gòu)域消除后，G3BP2蛋白表達減少，這是由于泛素化促進了蛋白降解(圖2J-L)。接下來，我們利用catRAPID平臺預(yù)測LINC01554中與G3BP2相互作用所必需的特異性結(jié)合序列。從圖2M中可以看出，1-600 bp的核苷酸序列交互得分較低，而600-800 bp的核苷酸序列交互得分最高。1400-1931 bp序列也呈現(xiàn)較高的交互得分。根據(jù)上述結(jié)果，并考慮LINC01554的二級結(jié)構(gòu)長度，LINC01554與G3BP2的實際結(jié)合序列可能在400-900 bp之間。此后，我們構(gòu)建并生物素化了LINC01554的三個截短片段(片段1:1 - 500 bp，片段2:400 - 900 bp，片段3:1400 - 1931 bp)，用于KYSE30細胞裂解液的RNA拉下實驗，發(fā)現(xiàn)LINC01554的片段2確實拉下了G3BP2(圖2N)。為了進一步研究LINC01554中片段2與G3BP2相互作用的不可或缺的功能，我們構(gòu)建了一個缺失片段2的LINC01554突變體。RIP和RNA pull-down檢測的結(jié)果顯示，片段2在介導(dǎo)LINC01554與G3BP2相互作用中發(fā)揮了不可或缺的作用(圖2O, P)。此外，在LINC01554中去除片段2后，G3BP2蛋白表達降低(圖2Q, R)。綜上所述，LINC01554主要通過400-900 bp的核苷酸結(jié)構(gòu)域與G3BP2的RRM結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

3）G3BP2在體外和體內(nèi)促進ESCC細胞轉(zhuǎn)移

鑒于G3BP2在ESCC中表達升高的臨床意義和機制，我們接下來探討G3BP2在ESCC進展中的作用。我們分別在內(nèi)源性G3BP2低表達細胞(KYSE410和KYSE510細胞)和內(nèi)源性G3BP2高表達細胞(KYSE30和KYSE150細胞)中建立了異位表達或敲除G3BP2的穩(wěn)定細胞系。Western blot檢測過表達和敲除效率(圖3A)。G3BP2在KYSE410和KYSE510細胞中的異位表達顯著增加了ESCC細胞的遷移和侵襲(圖3B)，而在KYSE30和KYSE150細胞中敲除G3BP2則顯著降低了細胞的轉(zhuǎn)移能力(圖3C, D)。我們進一步在體內(nèi)使用淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移性裸鼠模型評估了G3BP2的功能。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型小鼠中，敲除組的淋巴結(jié)更小、更輕，且G3BP2表達更低(圖3E)。在肺轉(zhuǎn)移模型小鼠中，我們還發(fā)現(xiàn)，敲除組分離的肺組織中，與對照組相比，轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)更少，G3BP2的表達更低(圖3F)。綜上所述，提示G3BP2在促進食管鱗癌轉(zhuǎn)移中具有重要作用，與其臨床意義一致。

4）G3BP2穩(wěn)定HDGF mRNA轉(zhuǎn)錄

為了確定G3BP2調(diào)控的mRNA轉(zhuǎn)錄物參與誘導(dǎo)ESCC轉(zhuǎn)移，我們對G3BP2敲除的KYSE30和KYSE150細胞進行了RNA-seq測序。根據(jù)P< 0.05和log2 (fold change) > 1的篩選標準，在KYSE30細胞和KYSE150細胞中分別鑒定出387和263個差異下調(diào)基因，其中在兩個細胞系中共有25個基因(圖4A)。我們發(fā)現(xiàn)在前10個差異下調(diào)基因中，無論KYSE30和KYSE150細胞中，HDGF都出現(xiàn)了較大的fold change，P值都非常顯著(圖4B)。為了驗證RNA-seq結(jié)果，我們檢測了穩(wěn)定的G3BP2敲除細胞株中HDGF的RNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與對照細胞相比，HDGF的RNA和蛋白水平顯著降低(圖4C)。免疫組化染色分析還顯示，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和來自G3BP2敲除KYSE150細胞的肺組織中HDGF低表達(圖4D)。接下來，我們試圖弄清楚G3BP2如何調(diào)節(jié)HDGF的表達。G3BP2屬于RNA結(jié)合蛋白類，已有報道通過其RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定SART3 mRNA轉(zhuǎn)錄。基于此，我們推斷G3BP2通過類似的機制調(diào)控HDGF的表達。我們進行了一個RIP試驗來驗證我們的推測，并發(fā)現(xiàn)G3BP2確實與HDGF mRNA轉(zhuǎn)錄本結(jié)合(圖4E)。mRNA半衰期實驗顯示，沉默G3BP2導(dǎo)致HDGF mRNA穩(wěn)定性顯著降低(圖4F)。最后，我們闡明了G3BP2和HDGF表達在ESCC中的相關(guān)性。我們在34個ESCC樣本的SYSUCC隊列中檢測G3BP2和HDGF的RNA表達水平，發(fā)現(xiàn)G3BP2和HDGF的表達呈正相關(guān)(圖4G)。這些發(fā)現(xiàn)表明G3BP2通過穩(wěn)定HDGF的mRNA轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)HDGF的表達。

5）LINC01554/G3BP2/HDGF信號軸促進ESCC細胞轉(zhuǎn)移

鑒于LINC01554控制著G3BP2的蛋白穩(wěn)定性，HDGF mRNA轉(zhuǎn)錄本受G3BP2調(diào)控，我們進一步研究LINC01554/G3BP2/HDGF調(diào)控信號軸是否在驅(qū)動ESCC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。首先，通過遷移和侵襲transwell實驗驗證了G3BP2和LINC01554相互作用對食管鱗癌轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示，在KYSE30細胞中，無論是消除G3BP2中的RRM結(jié)構(gòu)域，還是消除LINC01554中的片段2，都顯著減弱了細胞的遷移和侵襲能力(圖5A, B)。為了證實G3BP2介導(dǎo)LINC01554 -促進ESCC細胞轉(zhuǎn)移，我們在LINC01554轉(zhuǎn)染的KYSE30細胞中沉默了G3BP2。我們發(fā)現(xiàn)G3BP2蛋白表達明顯降低(圖5C)，細胞轉(zhuǎn)移消失(圖5D)。此外，誘導(dǎo)表達LINC01554逆轉(zhuǎn)了G3BP2的表達(圖5E)，并在G3BP2沉默后功能上挽救了細胞遷移和侵襲的減少(圖5F)。考慮到HDGF受G3BP2調(diào)控，我們在KYSE30細胞中檢測了HDGF的表達。結(jié)果顯示，異位表達LINC01554后，HDGF的表達水平升高，但刪除LINC01554與G3BP2相互作用的區(qū)域后，HDGF的表達水平降低(圖5G)。為了闡明HDGF在G3BP2介導(dǎo)的食管鱗癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，我們在G3BP2敲除細胞中表達了HDGF，并發(fā)現(xiàn)HDGF的蛋白表達被挽救(圖5H)。Transwell遷移實驗顯示，過表達HDGF促進ESCC細胞遷移，并有效挽救了沉默G3BP2引起的細胞遷移減少(圖5I)。最后，我們用RNA FISH檢測了LINC01554的表達，用IHC染色檢測了G3BP2和HDGF的表達，發(fā)現(xiàn)LINC01554、G3BP2和HDGF的表達具有相同的模式。在ESCC中，LINC01554高表達時，G3BP2和HDGF表達增加，而在相應(yīng)的非腫瘤組織中，LINC01554低表達，G3BP2和HDGF表達降低(圖5J)。綜上所述，LINC01554/G3BP2/HDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸在促進食管鱗癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

6）一種G3BP2抑制劑化合物C108能有效地消除體外和體內(nèi)ESCC細胞的轉(zhuǎn)移

化合物C108是Nisha Gupta等人在2017年開發(fā)的一種抑制包括G3BP2在內(nèi)的幾種蛋白質(zhì)的小分子。據(jù)報道，它可以阻斷RRM域，進而破壞SART3 mRNA的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致乳腺癌的腫瘤抑制。為了測試化合物C108是否可以消除G3BP2和LINC01554之間的相互作用，并可能用于阻斷G3BP2誘導(dǎo)的ESCC轉(zhuǎn)移，我們首先用化合物C108處理G3BP2過表達的KYSE410細胞，LINC01554轉(zhuǎn)染的KYSE30細胞和相應(yīng)的對照細胞，然后觀察G3BP2的表達和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力。Western blot結(jié)果顯示，化合物C108處理后細胞中G3BP2的表達顯著降低(圖6A)。由于G3BP2的表達減少，腫瘤細胞的遷移和侵襲均受到抑制(圖6B)。為了進一步證實化合物C108對G3BP2表達及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，我們將化合物C108引入內(nèi)源性G3BP2高表達的KYSE30和KYSE150細胞。化合物C108處理后的細胞中G3BP2表達降低，腫瘤細胞遷移和侵襲能力降低(圖6C, D)。此外，在轉(zhuǎn)染LINC01554的KYSE30細胞、KYSE30細胞和KYSE150細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移小鼠模型中，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，化合物C108處理組的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)體積更小、重量更輕(圖6E-G)。經(jīng)G3BP2和HDGF染色的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)切片顯示，與對照組相比，化合物C108處理組的G3BP2或HDGF的表達均顯著降低(圖6H)。綜上所述，化合物C108可能是一種有希望用于轉(zhuǎn)移性ESCC的治療方法。

結(jié)論：我們的研究結(jié)果確定了一個新的調(diào)控信號軸LINC01554/G3BP2/HDGF，促進食管鱗癌轉(zhuǎn)移，這可能為開發(fā)潛在的食管鱗癌生物標志物和治療靶點提供合理的策略。

參考文獻：

Zheng Y, Wu J, Deng R, Lin C, Huang Y, Yang X, Wang C, Yang M, He Y, Lu J, Su X, Yan Q, Zhu Y, Guan X, Li Y, Yun J. G3BP2 regulated by the lncRNA LINC01554 facilitates esophageal squamous cell carcinoma metastasis through stabilizing HDGF transcript. Oncogene. 2021 Nov 15. doi: 10.1038/s41388-021-02073-0. Epub ahead of print. PMID: 34782720.