非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發病率約占全世界人口的四分之一，持續的營養過剩是其主要原因之一。然而，其潛在的分子基礎尚未完全闡明，也沒有專門的藥物被批準用于這種疾病。目前，由作者發現了一個調控機制，揭示了Rab2A在NAFLD進展中基于能量狀態和PPARγ的新功能。該研究于2022年1月發表在《PLoS biology》，IF：8.029。

技術路線：

主要研究結果：
1.阻斷AMPK-TBC1D1軸導致老年小鼠肝臟脂質沉積
  作者在4 - 6月齡、12月齡和18月齡的TBC1D1-KI小鼠中檢測了NAFLD相關表型：12月齡和18月齡TBC1D1-KI小鼠肝臟切片大脂滴積累顯著增加(圖1A和1B)，同時TG水平嚴重升高(圖1C)。上述數據表明，阻斷AMPK-TBC1D1軸導致老年小鼠肝脂積累。然后對18個月大的小鼠肝臟進行RNA測序，熱圖分析脂質沉積類基因Cidea、Cidec和Plin4表達增加，它們是PPARγ的靶基因(圖1D)，q-PCR結果也證實了這些發現(圖1E)。此外，還觀察到12月齡和18月齡TBC1D1-KI小鼠PPARγ蛋白水平顯著升高，而PPARγ mRNA水平無明顯差異(圖1F-1H)，這些效應導致PPARγ活性升高。綜上所示，阻斷AMPK-TBC1D1軸可能通過激活PPARγ信號通路導致老年小鼠發生NAFLD。

2. AMPK-TBC1D1軸調控PPARγ的蛋白穩定性和功能
  AMPK激活劑A769662處理以劑量依賴的方式增加AMPK及底物乙酰COA羧化酶(ACC)的磷酸化，并且AMPK的激活狀態在空載體或WT TBC1D1或TBC1D1^S237A突變體的細胞中是相似的(圖2A和2B)。A769662激活AMPK后，外源性PPARγ2(圖2A)和內源性PPARγ(圖2B)逐漸下降，這與A769662的劑量有關。WT TBC1D1的表達同時提高了外源性PPARγ2和內源性PPARγ的表達，而在A769662處理下AMPK激活后，外源性PPARγ2和內源性PPARγ的表達仍然降低(圖2A和2B)。在TBC1D1^S237A突變體細胞中，A769662誘導的外源性PPARγ2和內源性PPARγ的減少被阻止(圖2A和2B)。
  接下來研究了TBC1D1 KI突變誘導的脂質儲存基因的表達是否確實是由PPARγ介導的。作者采用了兩種細胞模型，即表達TBC1D1^WT或TBC1D1^S237A蛋白的HepG2細胞和來自WT和TBC1D1^S231A-KI小鼠的原代肝細胞。TBC1D1^S237A突變蛋白的表達顯著增加了PPARγ靶基因PLIN3、PLIN5、CIDEA、FSP27/CIDEC、FABP1、FABP4和FABP5在HepG2細胞中的表達(圖2C)和細胞中TG含量的升高(圖2D)。同樣，PPARγ基因的敲除挽救了脂質儲存基因如Plin3、Plin5、Cidea、Fsp27/Cidec、Fabp1、Fabp4和Fabp5的表達(圖2E)，并阻止了TG在TBC1D1^S231A-KI小鼠原代肝細胞中的積累(圖2F)。總之，這些數據確定了AMPK-TBC1D1軸在調節PPARγ蛋白中的因果作用，并且AMPK-TBC1D1連接的破壞增加PPARγ蛋白，通過提高肝細胞中脂質儲存基因的表達促進TG積累。

3. Rab2A作為AMPK-TBC1D1軸的下游蛋白，調控PPARγ的蛋白水平
  體外結合實驗也證實了TBC1D1和PPARγ2之間的直接相互作用(圖3A)。而TBC1D1^S237A突變蛋白仍然具有與PPARγ相互作用的能力，其方式與WT TBC1D1類似(圖3A)，表明TBC1D1- s237磷酸化并不影響TBC1D1與PPARγ的相互作用。GAP非活性TBC1D1^R854K突變體的過度表達增加了PPARγ2蛋白，其程度類似于TBC1D1^S237A突變體蛋白(圖3B)。內源性PPARγ在Rab2A過表達細胞中升高(圖3C)，而在Rab2A敲低表達細胞中降低(圖3D)。在HepG2細胞中，TBC1D1^S237A蛋白的過度表達(而非WT TBC1D1)顯著增加了Rab2A的GTP結合形式(圖3E)。此外，在TBC1D1-KI小鼠(18個月大)的肝臟中，Rab2A的GTP結合形式顯著增加，而Rab2A的總水平不變(圖3F和3G)。這些數據表明，TBC1D1-S231A突變導致細胞中Rab2A的激活。TBC1D1 WT或S237A蛋白誘導的外源性PPARγ2(圖3H)的增加通過shRNA敲除Rab2A而減弱。在HepG2細胞中，Rab2A的敲除阻止了TBC1D1^S237A突變蛋白誘導的脂質儲存基因，包括PLIN3、CIDEA、FSP27/CIDEC、FABP1和FABP5(圖3I)，并阻斷了TG的積累(圖3J)。同樣，Rab2A基因的下調也恢復了脂質儲存基因Plin2、Plin3、Plin5、Cidea、Fsp27/Cidec、Fabp1、Fabp4和Fabp5的表達(圖3K)，并阻止了TG在TBC1D1S231A-KI小鼠原代肝細胞中的積累(圖3L)。這些數據表明，Rab2A在TBC1D1下游發揮基因作用，調控PPARγ在肝臟脂質儲存中的作用。

4.Rab2A的GTP結合形式結合并抑制PPARγ的蛋白酶體降解
  在共免疫沉淀試驗中，在Flag-Rab2A的免疫沉淀中發現內源性PPARγ(圖4A)。在體外GST-pulldown實驗中，GST-PPARγ2也能與Flag-Rab2A結合(圖4B)。此外，影像學研究顯示，部分PPARγ2-mCherry存在于細胞質中，并與主要存在于細胞質中的EGFP-Rab2A共定位(圖4C)。Rab2A的GTP結合形式顯著提高了內源性PPARγ(圖4D)的蛋白水平。此外，在共免疫沉淀試驗中，Rab2A的GTP結合形式與PPARγ2-MYC相互作用(圖4E)。在共免疫沉淀試驗中，AF-2結構域的缺失阻止了PPARγ2與Rab2A的結合(圖4F)。這些數據表明，Rab2A的GTP結合活性形式可能與PPARγ的AF-2結構域相互作用，從而提高PPARγ的蛋白質水平。用蛋白酶體抑制劑MG132和ALLN處理，都能以濃度和時間依賴的方式導致PPARγ2-MYC的積累(圖4G-4N)。過表達Rab2A顯著減弱了這些蛋白酶體抑制劑對PPARγ2-MYC積累速率的影響(圖4G-4N)。綜上所述，這些數據表明Rab2A的GTP結合形式與PPARγ的AF-2結構域結合，并抑制PPARγ的蛋白酶體降解。

5.營養狀態調控AMPK-TBC1D1-Rab2A軸的活性，進而調控PPARγ的蛋白水平
  DIO小鼠中的過度營養會使AMPK失活，從而導致肝臟中TBC1D1的磷酸化降低(圖5A和5B)。Rab2A在DIO小鼠的肝臟中成為GTP負載的活性形式(圖5A和5B)。DIO小鼠肝臟中Pparγ1和Pparγ2 mRNA水平均未發生變化(圖5C)，而蛋白水平顯著升高(圖5A和5B)。此外，DIO小鼠肝臟PPARγ靶基因也顯著增加(圖5C)。這些數據表明，AMPK-TBC1D1-Rab2A軸對營養過剩做出反應，以增加小鼠肝臟中的PPARγ蛋白。在HEK293T和HepG2細胞中，葡萄糖饑餓激活了AMPK通路，AMPK和ACC的磷酸化增加，使TBC1D1在237絲氨酸位點磷酸化(圖5D-5G)。葡萄糖饑餓降低了HEK293T細胞外源性PPARγ2- MYC的蛋白水平(圖5D和5F)，也降低了HepG2細胞內源性PPARγ的蛋白水平(圖5E和5G)。AMPK抑制劑化合物C劑量依賴性地抑制了葡萄糖饑餓誘導的AMPK激活，進而抑制了兩種細胞類型中葡萄糖饑餓誘導的TBC1D1磷酸化(圖5H和5I)。化合物C劑量依賴性地恢復外源PPARγ2- MYC在葡萄糖饑餓HEK293T細胞中的蛋白水平(圖5H)以及內源性PPARγ在葡萄糖饑餓HepG2細胞中的蛋白水平(圖5I)。此外，在HepG2細胞中，葡萄糖消耗降低了Rab2A的GTP結合形式，而化合物C逆轉了這種效應(圖5J)。綜上所述，這些數據表明AMPK-TCB1D1-Rab2A軸調節PPARγ蛋白水平以響應營養狀況。

6.Rab2A調節細胞脂質積累
  油紅O染色顯示，Rab2A穩定過表達導致HepG2細胞脂滴積累(圖6A和6B)。與對照組相比，過表達Rab2A的HepG2細胞的細胞TG和總膽固醇(TC)水平顯著升高(圖6C和6D)。基因本體論表達的差異基因主要參與TG穩態和脂蛋白顆粒重塑和運輸(圖6E)。在穩定過度表達Rab2A的HepG2細胞中，PPARγ靶基因的轉錄水平顯著增加，如PLIN4、CIDEA和FSP27/CIDEC(圖6F)。Rab2A對PPARγ靶基因表達及細胞TG積累的影響取決于其鳥嘌呤核苷酸結合狀態。與GTP結合的Rab2A^Q65L促進PPARγ靶基因的表達(圖6G)，并引起細胞中TG的積累(圖6H)。PPARγ基因的下調抑制了Rab2A^Q65L誘導的PPARγ靶基因的表達(圖6G)，并阻止了Rab2A^Q65L誘導的細胞TG積累(圖6H)。與過表達Rab2A相比，在HepG2細胞中穩定下調Rab2A可降低細胞脂滴數量(圖6I和6J)并抑制PPARγ靶基因的mRNA表達(圖6K)。這些數據表明，Rab2A通過PPARγ調控脂質儲存基因表達和細胞TG積累。

7.抑制Rab2A可減輕飲食誘導的肝脂積累
  通過AAV8介導的shRab2A下調DIO小鼠肝臟中Rab2A的表達。在給予表達shRNA的AAV8 2個月后，對小鼠進行分子和生理分析。小鼠肝臟的分子分析證實了Rab2A在mRNA和蛋白水平上的顯著下降(圖7A)。不僅shRab2A小鼠肝臟內源性PPARγ2蛋白顯著降低，而且這些小鼠的內源性PPARγ1蛋白也觀察到較不明顯的降低(p = 0.057)，同時PPARγmRNA保持正常(圖7A和7B)。除了PPARγ蛋白的降低，脂質代謝相關基因和膽固醇合成相關基因在蛋白水平上的表達降低，而FGF21在shRab2A小鼠的肝臟中顯著增加(圖7A和7B)。shRab2A小鼠肝臟中TG含量顯著降低(圖7C)，shRab2A小鼠肝臟TC水平下降(圖7D)，shRab2A小鼠血清TG和TC水平均顯著降低(圖7E和7F)。綜上所述，這些數據表明，抑制Rab2A降低了PPARγ蛋白，從而減輕了飲食誘導的體內肝脂積累。

結論：
  綜上所述，作者發現Rab2A在AMPK-TBC1D1軸下游發揮遺傳作用，調控肝臟PPARγ蛋白的穩定性，從而調控PPARγ靶基因的表達，使TG在肝臟中積累，以響應能量/營養狀態，這對脂肪肝的治療有重要意義。