大多數局限性人腎透明細胞癌(ccRCC)相關的死亡是由于癌癥的復發和轉移。然而，精確的分子機制在很大程度上仍是未知的。近年來，越來越多的lncRNA被證明是腫瘤發生的重要調控因子。本研究發現lncRNA DUXAP9具有預后價值，其m6A修飾通過激活PI3K/AKT信號通路促進腎癌細胞的增殖和運動。因此認為DUXAP9可能是一種有用的預后標志物和ccRCC的潛在治療靶點。本研究于2021年6月發表在《Frontiers in Oncology》IF：6.244期刊上。


技術路線：

主要實驗結果：
1、lncRNA DUXAP9在局限性ccRCC中上調并與不良預后呈正相關
       首先檢測了來自SYSUCC生物庫的112對原發性局限性ccRCC和鄰近非腫瘤組織中DUXAP9的表達。結果顯示，與癌旁非腫瘤組織相比，DUXAP9在ccRCC組織中表達增加(Figure 1A)。利用X-tile軟件(基于積分光密度)，獲得了將這些患者分為高表達組和低表達組的截斷值(Figure 1B)。此外，Kaplan-Meier分析表明，DUXAP9上調與較差的OS和PFS顯著相關(Figures 1C, D)。Umrc6和Caki-1細胞株中DUXAP9的表達明顯高于其他細胞株。使用FISH和亞細胞分離實驗證實DUXAP9不僅定位于Umrc6細胞的細胞核，而且也定位于細胞質(Figures 1F, G)。

       為了驗證上述結果，分析了TCGA數據在445個局限性ccRCC組織和72個正常腎組織中DUXAP9的表達情況。與正常腎組織相比，DUXAP9在局限性ccRCC中顯著上調(Figure 2A)。此外，如Figures 2B-D的小提琴圖所示，DUXAP9在局限性ccRCC中的表達隨著T分級(P=0.011)、分期(P=0.010)和分級(P=0.027)的增加而增加。此外，DUXAP9上調與較差的OS和PFS相關(Figures 2E, F)。
       綜上所述，DUXAP9在局限性ccRCC中上調表達并與不良預后呈正相關。

2、DUXAP9促進RCC細胞增殖，抑制細胞凋亡
       為了確定DUXAP9上調對局限性ccRCC的影響，在Umrc6和Caki-1細胞中使用靶向DUXAP9的shRNA敲除DUXAP9 (Figures 3A, B)，并在786-O細胞中過表達DUXAP9 (Figures 3C)。CCK-8和菌落形成實驗表明，DUXAP9敲低可顯著抑制Umrc6和Caki-1細胞的增殖，過表達DUXAP9可顯著增加786-O細胞的增殖(Figures 3D-I)。此外，DUXAP9敲除后，均可在Umrc6和Caki-1細胞中觀察到細胞凋亡。因此，作者想知道DUXAP9是否可以調節細胞凋亡，導致細胞增殖。流式細胞術顯示DUXAP9敲除后腎癌細胞的凋亡率明顯升高(Figures 3J, K)，且DUXAP9敲除后，抗凋亡蛋白Bcl-2顯著降低，促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved PARP顯著升高(Figure 3L)。這些結果證實了DUXAP9是一種重要的凋亡介質。

3、DUXAP9促進RCC細胞遷移和侵襲，參與EMT
       進一步探討了DUXAP9對腎癌細胞遷移和侵襲的影響，結果顯示， DUXAP9下調顯著抑制Caki-1和Umrc6細胞的體外遷移和侵襲能力；與對照細胞相比，DUXAP9在786-O細胞中的過表達顯著增加了細胞的遷移和侵襲能力(Figures 4A–F)。由于EMT在晚期腫瘤的運動能力中起著至關重要的作用，作者評估了RCC中的DUXAP9是否激活EMT通路。如預期的那樣，DUXAP9敲除Caki-1和Umrc6細胞后，N-cadherin、vimentin、β-catenin和Snail水平下降，而E-cadherin水平升高。相反，在786-O細胞中過表達DUXAP9后，E-cadherin水平下調，而N-cadherin、vimentin、β-catenin和Snail水平上調(Figures 4G)。以上結果表明DUXAP9促進RCC細胞遷移和侵襲，參與EMT。

4、IGF2BP2通過依賴m6A的方式提升DUXAP9的穩定性
       為了研究DUXAP9調控RCC的潛在分子機制，采用RNA pull-down和質譜分析來鑒定與DUXAP9結合的蛋白。在Caki-1細胞中，IGF2BP2直接與DUXAP9結合而不是反義對照 (Figure 5A)。此外，RIP-qPCR檢測驗證了在Caki-1細胞中IGF2BP2和DUXAP9之間的相互作用，使用IGF2BP2特異性抗體與對照IgG抗體比較，證實了DUXAP9的富集(Figure 5B)。IGF2BP2是一種RNA結合蛋白，被稱為m6A閱讀器，以依賴m6A的方式增強RNA的穩定性。
       利用SRAMP(一種m6A修飾位點預測器)在DUXAP9序列中發現了一個經典的m6A基序(GAACT)，因此作者想知道DUXAP9是否表現出m6A修飾，這可以維持其在腎癌細胞中的命運。MeRIP檢測和qPCR分析顯示，在Caki-1細胞中，DUXAP9與對照IgG抗體相比高度富集，證實了DUXAP9中m6A修飾(Figure 5C)。此外，通過pull-down檢測，DUXAP9中m6A基序的突變降低了IGF2BP2的結合(Figure 5D)。這說明IGF2BP2與DUXAP9的結合依賴于m6A修飾。
       為了探究IGF2BP2是否影響了DUXAP9在RCC中的穩定性，在Caki-1和Umrc6細胞中敲除IGF2BP2或METTL3，發現DUXAP9的水平一開始是下降的(Figures 5E, F)。然后，用轉錄抑制劑更生霉素處理IGF2BP2 敲除細胞，證實DUXAP9的半衰期顯著降低(Figures 5G, H)。同時，當敲除METTL3時，一種重要的m6A甲基轉移酶，被稱為m6A writer，METTL3在Caki-1和Umrc6細胞中的抑制作用使DUXAP9的半衰期顯著縮短(Figures 5I, J)。此外，在METTL3敲除后，與對照IgG抗體相比，使用IGF2BP2-或m6A特異性抗體時，DUXAP9在RIP-qPCR檢測中的富集顯著降低(Figures 5K, L)。這些結果表明，IGF2BP2在腎癌細胞中與DUXAP9結合，并以m6A依賴的方式促進DUXAP9的穩定性。

5、DUXAP9激活腎癌細胞中PI3K/Akt信號通路和Snail表達
       為了確定DUXAP9在RCC中的潛在作用機制，對DUXAP9敲除的Caki-1細胞和對照Caki-1細胞進行RNA測序，然后進行KEGG富集分析(Figure 6A)。發現DUXAP9與Akt信號通路相關，與TCGA數據的GSEA結果一致(Figure 6B)。此前有報道稱，通過激活Akt信號通路促進EMT在腫瘤進展中發揮重要作用。作者探討了DUXAP9是否參與了Akt誘導的EMT、腫瘤生長和侵襲。Western blotting證實與對照細胞相比，DUXAP9敲除的Caki-1和Umrc6細胞PI3K、p-Akt和p-mTOR下調。與此相反，在786-O細胞中DUXAP9過表達上調了這些蛋白的表達(Figure 6C)。

       為了進一步研究DUXAP9對RCC中Akt信號通路影響的機制，使用PI3K抑制劑LY294002試圖消除DUXAP9過表達對Akt信號通路的影響。用終濃度為20 μmol/L的LY294002培養24 h，隨后Western blotting分析顯示，LY294002可以抑制之前上調的p-mTOR、p-Akt、p-GSK3β和Snail的表達水平，并伴有DUXAP9過表達(Figure 7A)。Transwell細胞遷移/侵襲和傷口愈合實驗證實LY294002的使用顯著限制了DUXAP9過表達對體外遷移和侵襲能力的影響(Figures 7B–E)。通過CCK-8試驗和集落形成試驗證實了LY294002處理腎癌細胞也會削弱DUXAP9過表達細胞的腫瘤細胞生長進程(Figures 7F–H)。

參考文獻：
Tan L, Tang Y, Li H, Li P, Ye Y, Cen J, Gui C, Luo J, Cao J, Wei J. N6-Methyladenosine Modification of LncRNA DUXAP9 Promotes Renal Cancer Cells Proliferation and Motility by Activating the PI3K/AKT Signaling Pathway. Front Oncol. 2021 Jun 8;11:641833. doi: 10.3389/fonc.2021.641833. PMID: 34168980; PMCID: PMC8217835.