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caspase-4非典型炎癥小體的胞質固有免疫感應促進細胞衰老

欄目:最新研究動態 發布時間:2022-01-26
目前,有研究發現LPS介導的caspase-4的激活也會誘導應激反應,促進細胞衰老,這依賴于caspase-4底物......


   人類細胞中微生物脂多糖
(LPS)的胞質識別是由caspase-4caspase-5非典型炎癥小體引起的,它們誘導一種稱為焦亡的炎癥細胞死亡形式。目前,有研究發現LPS介導的caspase-4的激活也會誘導應激反應,促進細胞衰老,這依賴于caspase-4底物gasdermin-D和腫瘤抑制因子p53。該研究發表在《Cell Death & Differentiation》,IF15.828


技術路線:


主要研究結果:

1. Caspase-4識別LPS誘導人二倍體成纖維細胞衰老

為了檢測炎癥性caspasesLPS轉染后獲得衰老表型中的作用,在轉染前用shRNA下調CASP1CASP4的表達(1A)。與caspase-1相比,caspase-4在獲得衰老特征方面是必需的(1B-D)。然而,CASP4的過表達加劇了細胞內LPS存在下的衰老特征的獲得(1E, F),表明caspase-4的表達對非典型炎癥小體誘導的衰老至關重要。caspase-4gasdermin-D的下調,會導致LPS轉染介導的細胞死亡,這證實了細胞因焦亡而死亡(圖1G)。總之,這些結果表明,細胞內LPS暴露后的衰老表型的獲得是通過caspase-4介導的,且呈劑量依賴性。

通過shRNA,研究caspase-4底物gasdermin-Dp53LPS誘導的衰老和焦亡中的作用。TP53GSDMD基因敲除顯著降低了LPS依賴性細胞生長停滯,以及p53p21CIP1的誘導(1H, I, J)。在LPS誘導的衰老過程中,GSDMD的下調對p16INK4acaspase-4的誘導產生了強烈的影響(1J)。這些結果表明,由非典型炎癥體感應的細胞質LPS誘導了依賴于caspase-4gasdermin-Dp53表達的衰老反應。

1 LPS介導的caspase-4活化誘導人原代成纖維細胞衰老表型


2. 
caspase-4介導的LPS誘導的衰老反應與
IL-1β啟動無關

IMR90成纖維細胞中唯一過表達CASP4CASP1的衰老誘導并沒有誘導IL1B的轉錄激活(2A)。相比之下,IL1B轉錄水平在LPS轉染后以caspase-4依賴的方式增加(2B)。作者之前已經證明TLR2在細胞衰老中控制IL1B表達和SASP的作用。因此,進一步研究TLR2介導的炎性小體啟動是否與LPS介導的caspase-4誘導的衰老協同作用。用TLR2激動劑Pam2CKS4啟動炎癥小體與LPS轉染顯著協同,以產生強大的IL-1β誘導,并且這種誘導通過CASP4異位過度表達進一步增強(2C)。然而,通過添加Pam2CKS4,沒有觀察到LPS誘導的衰老中細胞增殖或SA-β-半乳糖苷酶誘導的顯著減少(2D, E)。然而,與OIS中觀察到的對數增長相比,在所有條件下,LPS轉染細胞中觀察到的IL1B mRNA水平的增加都是最小的(2C)。這些結果表明,在LPS介導的細胞衰老過程中,caspase-4刺激的額外信號,如持續啟動信號,對于IL1BSASP的強烈誘導是必要的。此外,這些數據表明LPS誘導的caspase-4衰老反應是獨立于IL1BSASP的。

2 LPS介導的caspase-4誘導的衰老不依賴于炎性小體啟動


3.
caspase-4的蛋白水解活性對LPS誘導的衰老不是必需的

為了進一步研究caspase-4蛋白酶的蛋白酶活性對衰老的貢獻,caspase-4野生型和催化死亡突變體C258ACASP4C258A)在IMR90細胞中過度表達(3A),并評估表型結果。野生型CASP4CASP4C258A的過度表達在類似程度上減少了細胞增殖并增加了SA-β-半乳糖苷酶活性(3B, C)LPS轉染前,CASP4野生型和CASP4C258AIMR90成纖維細胞中穩定過表達(3D)。在LPS轉染后,表達CASP4C258A而非CASP4野生型的IMR90細胞對細胞死亡具有抵抗力(3E),表明caspase-4缺陷型在細胞焦亡中起主要的負作用。然而,在LPS刺激后,CASP4野生型和CASP4C258A過表達細胞對衰老特征的獲得同樣敏感(3F)。這些結果表明,與caspase-4介導的細胞焦亡相反,caspase-4LPS誘導的衰老中的作用與其催化活性無關。

3 Caspase-4介導的衰老調控獨立于其催化功能


4.
在癌基因誘導的衰老過程中,caspase-4非經典炎癥體被誘導和組裝

接下來,研究炎性caspase-4在癌基因誘導衰老(OIS)中的作用。為了誘導OIS, HRASG12V(以下簡稱RASG12V) IMR90人成纖維細胞中持續過度表達。RASG12V過表達降低了細胞增殖,增加了SA-β-半乳糖苷酶活性(4A)。與細胞周期抑制劑p21CIP1p16INK4ap15INK4b的上調相一致,RASG12V過表達后,caspase-4mRNA和蛋白質水平的表達均增加(4B, C)。接下來,作者利用他們和其他人廣泛使用的誘導系統來嚴格控制衰老的開始。在該系統中,雌激素受體(ER)配體結合域的突變形式與相關蛋白(RAS)融合;因此,在添加4-羥基三苯氧胺(4OHT)后,ER:RAS細胞發生OIS(4D)。與未處理的IMR90 ER:RAS細胞相比,加入4OHT后,IMR90 ER:RAS細胞增殖停止,SA-β-半乳糖苷酶活性增加(4D)。使用該系統的時間過程實驗顯示,在OIS處理的細胞中,CASP4 mRNA水平與IL1B mRNA表達呈指數增長并行增加(4E, F) caspase-4蛋白水平也呈指數增長(4G)4OHT處理后3天,在IMR90 ER:RAS衰老細胞中檢測到內源性caspase-4寡聚,但在對照細胞中未檢測到(4H)。此外,在添加4OHT4天和8天,IMR90 ER:RAS細胞中caspase-4蛋白水解活性也增加(4I)。這些結果表明,在OIS中誘導了caspase-4的表達,并組裝了非標準炎癥小體。

4 caspase-4非典型炎癥小體在癌基因誘導的衰老中被激活


5.
OIS中,caspase-4非典型炎癥小體是炎癥信號轉導所必需的

接下來,在IMR90 ER:RAS系統中研究了caspase-4OIS中的功能作用。IMR90 ER:STOPER:RAS細胞轉染對照組和CASP4靶向小干擾RNAsiRNA),在加入4OHT5天和8天收集樣本,分別在caspase-4激活后和完全SASP形成后收集樣本,并進行轉錄組分析(5A)。差異表達基因分析發現,在CASP4敲除后,有557478個基因顯著差異表達(FDR 10%),其中340個和240個基因分別在加入4OHT5天和8天后,在RASG12V-OIS細胞中以CASP4依賴方式誘導表達(5A)。進行基因組富集分析(GSEA)顯示,在加入4OHT5天和8天后,RASG12V-OIS細胞中與炎癥過程(包括TNF-α信號和干擾素反應)相關的基因組存在CASP4依賴調節(5B)。繪制炎癥反應基因組中所有基因的對照組IMR90 ER:STOPCASP4敲除與對照組IMR90 ER:RAS細胞的折疊變化值的熱圖,揭示了一種模式,通過該模式,如果以CASP4為靶點,包括SASP因子,在衰老過程中增加的炎癥相關基因的表達被消除(5C)RT-qPCR驗證IL1AIL1B表達的變化(5D, E)。當CASP4OIS中被靶向時,SAA1SAA2的表達也降低了(5F, G)。此外,當CASP1CASP4被靶向時,細胞內成熟IL-1β的水平也顯著降低(5H, I, J)。此外,當CASP4被靶向時,在RASG12V誘導的細胞培養條件培養液中,分泌IL-1β的濃度顯著降低(5K)。此外,用兩個逆轉錄病毒shRNA載體抑制CASP4的表達也會影響OISIL1BIL6IL8 mRNA的誘導,增加了數據的特異性和穩健性(5L)。總的來說,這些結果表明caspase-4參與了caspase-1介導的OISSASP的激活。

5 Caspase-4激活調控促炎SASP


6.
OIS中,caspase-4非典型炎癥小體有助于抑制細胞增殖

在使用shRNA逆轉錄病毒載體的長期細胞生長試驗中,casp4靶向siRNA轉染顯著挽救了早期細胞增殖停滯(6A),并增加了總細胞含量(6B, C)GSEA顯示CASP4RASG12V-OIS基因標記”G2M CHECKPOINT””E2F TARGET”中呈負性調控,CDKN2A (p16INK4a-p14ARF)CDKN2B (p15INK4b)位點的表達,而p21CIP1沒有表達(5B6D)。靶向CASP4降低了p16INK4a的表達,挽救了pRb的磷酸化(圖6E),并導致E2F靶基因水平的轉錄增加(圖6F),這表明caspase-4通過控制OISp16INK4ap15INK4b的表達來調節細胞增殖。這些結果表明,caspase-4有助于阻止細胞衰老過程中的增殖,最終影響pRb的磷酸化狀態,從而導致E2F靶基因的轉錄抑制。

6OISCaspase-4有助于抑制細胞增殖


7.
Caspase-11在體內細胞衰老過程中被誘導

OIS模型中分析了caspase-4小鼠同源caspase-11的表達,在該模型中,Pdx-CRE條件表達KrasG12D誘導小鼠胰腺中胰腺上皮內瘤變(PanIN)(7A)。在野生型小鼠中,與周圍胰腺腺泡細胞、較高級別的PanINs以及導管和腺泡細胞相比,低級別PanINscaspase-11呈陽性染色(7A)PanINKi-67染色的定量顯示,caspase-11的表達僅限于具有低增殖指數的早期衰老病變(7B),表明caspase-11表達與低級別PanIN病變中的低細胞增殖相關。與野生型小鼠相比,nfkb1-/-小鼠的肺中脂褐素積累增加(7C)。在表達caspase-11的細胞中檢測到類似的脂褐素積累增加(7C)。此外,在野生型和nfkb1-/-小鼠的小氣道上皮細胞中發現了p21caspase-11之間的相關性(7D),表明在小鼠加速衰老模型中,caspase-11與衰老標志物相關。老年小鼠(24個月)的肺泡細胞顯示端粒相關DNA損傷反應foci數量增加(7E),這是組織中衰老細胞積累的標志,我們發現這與caspase-11的增加同時發生(7F)。總之,這些結果支持非典型炎癥小體促進體內衰老的模型。

7 Caspase-11在體內衰老過程中的表達


主要結論:

細胞衰老是由非典型炎癥小體的胞質LPS識別誘導的,并且這一途徑在細胞對致癌應激的反應中是保守的。作者提出非經典炎癥小體的操縱可以為針對SASPseno-therapies提供新的理論基礎,并誘導癌癥和衰老中的細胞焦亡。