肝內膽管癌(ICC)是一種原發性肝癌，侵襲性高，預后極差。circRNAs在ICC癌變發生和進展中的作用仍有待確定。我們研究發現來自ACTN4基因外顯子1-外顯子20的Hsa_circ_0050898(命名circACTN4)在ICC中顯著上調。circACTN4的高表達與體外和體內腫瘤增殖和轉移增強以及ICC切除術后較差的預后相關。此外，circACTN4通過海綿蛋白miR-424-5p上調YAP1的表達。更重要的是，circACTN4還招募YBX1刺激FZD7轉錄。circACTN4在ICC細胞中的過表達增強了YAP1和β-catenin之間的相互作用。這些結果表明circACTN4是ICC潛在的預后標志物和治療靶點。本文于2021年9月發表在“Journal of Hepatology”（IF: 25.083）期刊上。

技術路線

結果

1）CircACTN4在ICC組織中上調

芯片分析顯示與鄰近的非腫瘤組織比較，以log2 fold change >4.0 和p <0.05 為前提，17個circRNA在ICC組織中顯著上調(圖1A,B)。在 4個高表達的circRNA中，circACTN4的上調最顯著。通過60對樣品的qRT-PCR，證實了circACTN4在ICC組織中過表達，并對RNase R處理產生了抵抗(圖1C,D)。通過qRT-PCR檢測細胞中circACTN4的表達，在RBE和FRH0201細胞中分別發現了circACTN4的低表達和高表達(圖1E)。使用熒光原位雜交和亞細胞分離試驗，在RBE和FRH0201細胞的細胞核和細胞質中觀察到circACTN4轉錄本(圖1F,G)。與低circACTN4表達相比，在ICC中高circACTN4表達與較差的3年總生存率和更高的復發率相關 (圖1H, I)。

2）CircACTN4促進體外和體內ICC細胞的增殖和侵襲

在集落形成實驗中，過表達circACTN4促進RBE細胞的增殖，而敲除circACTN4抑制FRH0201細胞的增殖(圖2A)。在transwell實驗中，RBE細胞的遷移和侵襲增強，而FRH0201細胞的遷移和侵襲被抑制(圖2B)。在內皮管形成實驗中，RBE細胞上清液的促血管刺激因子增加了管長，而FRH0201細胞上清則相反(圖2C)。在異種移植模型中，circACTN4沉默組肺轉移數量和腫瘤生長較低，而circACTN4過表達組較高(圖2D-G)。

3）CircACTN4調控FZD7在ICC細胞中的表達

RNA-seq在過表達circACTN4的RBE細胞中鑒定出103個差異表達基因 (圖3A, B)。KEGG通路分析顯示，Hippo相關基因(MOB1B、ID2、APC、PPP1CB、CCN2、PRKCI、BMPR2、YAP1和YWHAG)和wnt相關基因(ROCK2、EP300、APC、FZD7和AXIN2)均富集并過表達circACTN4。qRT-PCR進一步證實了這些基因在過表達circACTN4的RBE細胞中過表達(圖3C, D)。Western blot結果顯示，FZD7、ID2、CCN2和AXIN2的蛋白水平也隨著circACTN4的過表達或敲除而改變(圖3E)。

FZD7，Wnt/β-catenin通路的受體，在Hippo和Wnt通路中與ICC細胞中circACTN4過表達相關均升高。RNA-seq結果顯示，在circACTN4沉默的FRH0201細胞中，FZD7的表達顯著下調。在RNA-seq的559個DEGs中，Hippo信號通路也顯著富集(圖S5C-F)。利用TCGA數據庫進一步分析發現，FZD7在ICC組織中的表達水平顯著高于非腫瘤組織(圖3F)。這些結果通過組織樣本的qRT-PCR和IHC進一步證實(圖3G, H)。此外，在20個ICC組織中，circACTN4的表達與FZD7的表達呈正相關(圖3I)。為了確定circACTN4是否調控FZD7的轉錄，我們在FRH0201細胞中進行了ChIRP (RNA提取染色質)實驗，結果顯示circACTN4在FZD7啟動子轉錄起始位點(TSS)的?1200到?800 bp區域富集(圖3J)。同時，在FRH0201細胞中，circACTN4沉默后，H3K27Ac組蛋白活性修飾在同一位點的富集減少，而在RBE細胞中，過表達circACTN4后，H3K27Ac組蛋白活性修飾增加(圖3K, L)。這些結果表明，circACTN4可以結合FZD7啟動子并觸發FZD7的表達。

4）CircACTN4與YBX1相互作用

RNA下拉和western blotting顯示，生物素標記的circACTN4探針可以在FRH0201細胞裂解液中沉淀內源性的YBX1(圖4A)， RIP和RNA EMSA進一步證實了這一點(圖4B, C)。這些結果表明circACTN4和YBX1之間存在相互作用。circACTN4的表達與YBX1呈正相關(圖4D)。此外，TCGA數據顯示，YBX1在ICC組織中的表達明顯高于非腫瘤組織(圖4E)，這一點通過qRT-PCR和IHC在ICC組織樣本、RBE和FRH0201細胞系中得到了驗證(圖4F, G)。circACTN4在RBE細胞中過表達，在FRH0201細胞中敲除，均不影響YBX1 mRNA的表達(圖4G)。這些結果表明，circACTN4與YBX1相互作用，并在ICC進展過程中啟動下游基因轉錄。

5）CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7的轉錄

ChIP-seq分析顯示，FRH0201細胞中YBX1結合區域廣泛分布于基因組中，其中24.88%為啟動子(圖5A, B)。對YBX1結合區域的Motif分析顯示其結合序列偏好存在差異(圖5C)。通過重疊RNA-seq和ChIP-seq的結果，我們發現FZD7是ICC細胞中circACTN4和YBX1的靶點(圖5D)。ChIP-qPCR結果顯示，YBX1在ICC細胞中參與FZD7表達的調控，因為YBX1與FZD7啟動子在同一位點富集(圖5E)，這與circACTN4的結果一致(圖3J)。此外，在FRH0201細胞中，YBX1敲低抑制了H3K27Ac修飾在FZD7啟動子上的富集(圖5F)。為了進一步證實circACTN4和YBX1共同調控FZD7的轉錄，我們在FRH0201細胞中敲除circACTN4，發現YBX1在FZD7啟動子上的富集減少(圖5G)。FZD7 mRNA和蛋白水平在FRH0201細胞中的變化也與YBX1過表達和敲低一致(圖5H)。細胞功能實驗表明，YBX1恢復挽救了FZD7下調介導的FRH0201細胞生長、血管形成和轉移的抑制(圖5I-L)。這些結果提示circACTN4可能在YBX1介導的FZD7在ICC細胞中的表達中起重要作用。

6）CircACTN4通過海綿吸收miR424-5p上調YAP1的表達

circRNA Interactome數據庫預測circACTN4可作為多個miRNA的海綿。通過結合來自Starbase和Circbase的miRNA靶點預測結果，12個候選miRNA被預測為circACTN4和YAP1的靶點(圖6A)。使用TCGA，發現12個候選基因中有6個在ICC組織中表達。此外，在轉染si-circACTN4的FRH0201細胞中，只有miR-424-5p上調(圖6B)，而在RNA RIP檢測中，circACTN4可直接與miR-424-5p結合(圖6C)。轉染miR-424-5p的模擬物可降低RBE細胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖6 D,E)。此外，在轉染miR-424-5p mimic的RBE細胞中，YAP1 mRNA和蛋白水平顯著降低，這與轉染miR-424-5p inhibitor的RBE細胞中的YAP1 mRNA和蛋白水平形成鮮明對比(圖6F)。這些結果表明，circACTN4通過海綿吸收miR-424-5p調節YAP1的表達。此外，熒光素酶報告基因檢測顯示，與對照組相比，在與miR-424-5p模擬物和野生型熒光素酶報告基因共轉染的HEK-293 T細胞中，熒光素酶活性顯著降低(圖6G)。RIP實驗也顯示，與IgG組相比，argonaute 2組circACTN4和miR-424-5p的富集量增加(圖6H)。這些發現表明circACTN4在ICC細胞中充當了miR-4245p上調YAP1的海綿。

7）CircACTN4參與Wnt/Hippo信號通路

由于FZD7是Wnt信號通路受體，我們推測circACTN4可能通過促進FZD7轉錄參與了該通路的調控。β-catenin和p-GSK3b表達的變化與circACTN4過表達或敲低一致(圖7A)。在circACTN4過表達的RBE細胞中，β-catenin的核定位顯著增加，而在circACTN4下調的FRH0201細胞中，β-catenin的核定位顯著降低(圖7B)。TOP/FOP-Flash報告分析也顯示，Wnt/β-catenin通路活性分別隨circACTN4過表達或敲除而顯著增加或降低(圖7C)。我們進一步通過免疫熒光檢測了circACTN4對β-catenin和YAP1蛋白細胞定位的影響(圖7D)。結果顯示，YAP1和β-catenin在過表達circACTN4的RBE細胞中共定位，而circACTN4促進了它們的核積累。共免疫沉淀進一步證實了YAP1與β-catenin的相互作用增強(圖7E)。這些結果表明，circACTN4增強了YAP1與β-catenin、Hippo和Wnt通路的相互作用，促進了它們在ICC中的激活。

結論：CircACTN4在ICC中上調，通過作為miR-424-5p的分子海綿，以及與YBX1相互作用轉錄激活FZD7，促進ICC增殖和轉移。這些結果表明circACTN4是ICC潛在的預后標志物和治療靶點。

參考文獻：Chen Q, Wang H, Li Z, Li F, Liang L, Zou Y, Shen H, Li J, Xia Y, Cheng Z, Yang T, Wang K, Shen F. Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription. J Hepatol. 2021 Sep 9:S0168-8278(21)02025-0. doi: 10.1016/j.jhep.2021.08.027. Epub ahead of print. PMID: 34509526.