細胞凋亡是維持機體內環境穩定的關鍵，并產生大量凋亡細胞外小泡（apoEV）。幾種類型的癌細胞表面由于Fas表達減少，因此能夠逃避Fas配體誘導的凋亡。然而，正常細胞來源的載脂蛋白EV是否能調節腫瘤生長尚不清楚。目前，有研究確定了apoEV在誘導多發性骨髓瘤（MM）凋亡中的作用，并提示了apoEV治療MM的潛力，該研究發表于2012年9月發表在《ACS NANO》，IF：15.881。

技術路線：

主要研究結果：
1. ApoEVs抑制多發性骨髓瘤進展

作者前期先分離與表征MSC衍生apoEVs。然后為了在體內測試MSC來源的apoEVs對MM的影響，作者通過尾靜脈將5TGM1骨髓瘤細胞輸注到NOD/SCID小鼠中，生成一個具有侵襲性的同基因MM小鼠模型（圖1A）。另外還發現apoEVs顯著延長MM小鼠的壽命、抑制腫瘤生長（圖1B-D）。免疫熒光染色和流式細胞分析進一步證實，與對照組相比，MM小鼠股骨骨髓中CD138+漿細胞和CD45+CD19 CD138+骨髓瘤細胞數量增加，ApoEVs顯著抑制MM小鼠病理浸潤的骨髓瘤細胞（圖1E，F）。ELISA分析顯示，apoEV治療顯著降低MM小鼠升高的IgG2b水平（圖1G）。MicroCT和組織學分析顯示，5TGM1細胞接種后25天，骨小梁骨密度(BMD)和骨小梁體積分數下降，ApoEVs輸注顯著恢復MM小鼠的骨密度和BV/TV（圖1H，I）。此外，組織學分析顯示MM小鼠表現出嚴重的急性腎損傷，而apoEV治療顯著挽救了腎損傷（圖1J）。

圖1間充質干細胞來源的apoEVs抑制MM細胞生長

2.  ApoEVs利用FasL誘導多發性骨髓瘤細胞細胞凋亡

ApoEV在體外治療后6、24和48 h以劑量依賴性的方式誘導5TGM1細胞死亡（圖2A）。此外，流式細胞儀分析顯示，apoEV處理提高了Annexin v陽性的凋亡5TGM1細胞數量，并呈劑量依賴性（圖2B）。通過TUNEL染色和Western blotting檢測，ApoEV處理顯著誘導5TGM1細胞凋亡，上調cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的表達（圖2C，D）。ApoEV處理顯著增加了股骨中cleaved caspase-3和CD138雙陽性凋亡骨髓瘤細胞的數量（圖2E）。ApoEV輕微提高了5TGM1細胞FasL和Fas的表達，而apoEVs顯著提高了5TGM1細胞FasL相關死亡域蛋白的表達，降低了抗凋亡蛋白的表達水平(圖2F)。與MSCs和5TGM1細胞相比，MSC來源的apoEV顯示FasL和Fas的表達升高(圖2G)。Fas^lprMSC-衍生的 Fas-deficient apoEV能夠誘導5TGM1細胞凋亡（圖2H，I）。為使用Fasl小干擾RNA (siRNA)產生Fasl-depletion apoEVs，通過流式細胞分析評估發現，它們未能誘導5TGM1細胞凋亡（圖2J）。挽救Fasl表達可恢復Fasl^mut - apoEV誘導5TGM1細胞凋亡的能力（圖2K），提示Fasl是apoev誘導骨髓瘤細胞凋亡所必需的。

圖2 ApoEVs通過FasL/Fas途徑誘導MM細胞凋亡

3.  FasL在apoev介導的多發性骨髓瘤治療中是必需的

Fasl缺陷的Fasl^mut-apoEVs未能延長MM小鼠的壽命，也未能抑制腫瘤生長（圖3A，B）。ELISA分析、MicroCT和組織學分析顯示，Fasl缺陷Fasl^mut-apoEVs未能降低MM小鼠血清IgG2b水平，以及挽救BMD、BV/TV和腎臟損傷（圖3D-F）。而挽救Fasl表達可以恢復Fasl缺陷的apoEVs受損的治療能力 (圖3A, B)。組織學分析顯示，Fasl過表達恢復了Fasl缺陷apoev的能力，降低血清IgG2b水平，恢復MM小鼠的BMD、BV/TV和腎臟損傷（圖3C-F）。

圖3 ApoEVs在小鼠體內通過FasL誘導MM細胞凋亡

4.  ApoEVs促進Fas從細胞質到多發性骨髓瘤細胞表面的運輸

Fas激活抗體和重組FasL均未能誘導5TGM1細胞凋亡，提示MM細胞中Fas激活通路被破壞（圖4A）。Fas分布在5TGM1細胞的整個細胞質中，并且pkh26標記的apoEVs聚集在骨髓瘤細胞表面，并誘導細胞表面Fas明顯聚集（圖4B）。Western blotting結果顯示，apoEV處理提高了MM細胞細胞膜上Fas的表達，但降低了細胞質中Fas的水平（圖4C）。流式細胞分析進一步證實apoEVs增加了5TGM1細胞表面的Fas表達（圖4D）。ApoEVs在MM小鼠股骨骨髓中誘導Fas膜移位（圖4E，F）。ApoEVs輸注后，Fas明顯轉移到CD138陽性的骨髓漿細胞表面（圖4E）。流式細胞分析也證明apoEVs顯著增加了MM小鼠CD138+骨髓漿細胞表面Fas的比例（圖4F）。

圖4 ApoEVs誘導Fas進入細胞膜。

5.  ApoEVs直接接觸MM細胞，通過引起Ca2+內流和胞漿Ca2+升高誘導Fas膜運輸

在apoEV處理后的6小時內，大多數apoEVs直接與5TGM1細胞表面區域接觸，而在這段處理后的時間內，只有少數apoEVs可以在細胞質中發現(圖5A)。Z-stack two-dimensional SIM顯微鏡圖像和定量分析證實，許多apoEVs與細胞表面重疊，但不在細胞表面內部(圖5B,C)。ApoEV處理顯著增加了5TGM1細胞內的鈣離子 (圖5D)。ApoEV處理增強了5TGM1細胞中Cav1.2和Cav1.3的膜表達，但降低了它們的細胞質表達，而Cav1.1的表達沒有改變（圖5E）。ApoEV介導的細胞內鈣內流被L型Ca2+通道抑制劑阻斷，并被L型鈣通道激活劑激活（圖5 F，G），表明apoEV誘導的Ca2+內流依賴于L型鈣通道。最重要的是，通過流式細胞術分析、免疫熒光染色和Western blotting（圖5F-I）評估，L型Ca2+通道抑制劑處理5TGM1細胞可阻斷apoEV治療后Fas的細胞表面易位，降低了apoEV治療后5TGM1細胞凋亡，而BayK處理增強了凋亡（圖5J）。

圖5 apoEV誘導的Fas運輸到細胞膜依賴于Ca2+的流入

6.  骨髓瘤細胞來源的apoEVs未能改善多發性骨髓瘤

5TGM1MM細胞來源的apoEVs未能延長MM小鼠的壽命(圖6A)。MicroCT分析顯示，與MSC來源的apoEVs相比，5TGM1細胞來源的apoEVs未能挽救BMD和BV/TV的下降(圖6B,C)。5TGM1細胞源apoEVs在體外不能增加MM細胞膜中Fas的表達，也不能誘導MM細胞凋亡(圖6D,E)。此外，5TGM1細胞來源的apoEVs表達的FasL水平明顯低于MSC來源的apoEVs(圖6F)。來自MSCs的apoEVs，而不是來自MM腫瘤細胞的apoEVs，可以誘導MM細胞凋亡和改善MM表型。因此，MSCs是臨床前和臨床研究中產生apoEVs的合適細胞來源。

圖6 5TGM1細胞源apoEVs對MM細胞的影響

主要研究結論：

MSC來源的外源性apoEVs可以通過激活FasL/ Fas信號通路抑制MM細胞生長，減輕骨髓瘤骨病。此外，apoEVs通過提高MM細胞的胞質Ca2+，促進Fas蛋白從細胞質運輸到細胞膜。apoEV誘導Fas轉位至MM細胞膜，apoEV表面FasL直接誘導MM細胞凋亡。這種一箭雙雕的效應可能為MM的治療策略提供了一種很有前途的方法。這一發現為目前對EVs和腫瘤相互作用的理解提供了見解，并為MSC來源的apoEV具有作為無細胞治療腫瘤的潛力提供了證據。