m6A是哺乳動物中最豐富的mRNA修飾，參與了mRNA的代謝。KIAA1429被認為是最大的m6A甲基轉移酶，在m6A修飾中發揮重要作用。然而，KIAA1429在結直腸癌(CRC)中的預后價值和功能尚不清楚。我們研究發現KIAA1429在結直腸癌組織中顯著上調。KIAA1429高表達患者的總生存期較低表達患者短。KIAA1429在體外和體內均能促進結直腸癌細胞的增殖。KIAA1429通過與WEE1 mRNA 3′-UTR第三段結合，以m6A獨立的方式降低WEE1的穩定性，從而對WEE1的表達產生負調控作用。此外，丁酸通過下調轉錄因子NFκB1的水平降低了KIAA1429的表達。這些結果提示KIAA1429可能是CRC潛在的預后指標。本文于2021年11月發表在“Oncogene”（IF: 9.867）期刊上。

技術路線

結果

1）KIAA1429在人CRC中表達上調

我們對TCGA數據庫和GEO數據集進行分析，發現與相鄰正常組織相比，結直腸癌組織中KIAA1429的mRNA表達升高(圖1A)。此外，KIAA1429的高表達與臨床分期進展相關(圖1B)。通過TCGA數據庫分析，ROC曲線下面積(AUC)為0.70(圖1C)。ROC分析結果提示KIAA1429可能是CRC的診斷標志物。Kaplan Meier生存分析表明，KIAA1429表達高的CRC患者的OS比KIAA1429表達低的CRC患者的OS短(圖1D)。為了證實TCGA數據庫和GEO數據集中分析的結果，我們通過qRT PCR檢測了43對結直腸癌組織和鄰近正常組織中KIAA1429的表達，并通過IHC檢測了5對結直腸癌組織和鄰近正常組織中KIAA1429的表達。結果表明，在mRNA和蛋白質水平上，與相鄰正常組織相比，結直腸癌組織中KIAA1429的表達顯著增加（圖1E、G）。通過43對CRC組織和相鄰正常組織分析，AUC為0.66(圖1F)，這驗證了KIAA1429可能是CRC的診斷生物標志物。Kaplan–Meier生存分析表明KIAA1429高表達的結腸癌患者OS和無進展生存率（PFS）較差（圖1H，I）。總之，這些發現表明KIAA1429在結腸癌組織中升高，可能是結腸癌患者的預后生物標志物。

2）KIAA1429在體內外促進結直腸癌細胞增殖

CCK-8和集落形成分析表明KIAA1429的下調抑制了結直腸癌細胞的增殖和集落形成能力（圖2A，C），而KIAA1429的過表達促進了結直腸癌細胞的增殖和集落形成能力（圖2B，D）。細胞周期分析表明，KIAA1429的敲除增加了G2期細胞的百分比（圖2E），KIAA1429的過表達降低了G2期細胞的百分比（圖2F）。此外，沉默KIAA1429表達顯著抑制體內CRC腫瘤生長和腫瘤重量（圖2G-I）。綜上所述，這些結果表明KIAA1429可能作為癌基因在體外和體內促進結直腸癌增殖。

3）KIAA1429負調控WEE1表達

為了進一步探索KIAA1429促進結直腸癌細胞增殖的分子機制，我們在KIAA1429敲除細胞和相應的對照細胞中進行RNA-seq檢測（圖3A）。在我們之前的研究中，進行了RNA免疫沉淀和mRNA高通量測序（RIP-seq），以確定與KIAA1429蛋白相關的mRNA。在本研究中，我們通過結合RNA-seq和RIP-seq鑒定的差異表達基因進行Venn分析，結果顯示63個基因重疊（圖3B）。KEGG途徑分析表明，細胞周期途徑是最豐富的途徑，主要包括WEE1、染色體1A的結構維持、轉錄因子Dp-1和小染色體維持復合物成分3。通過qRT PCR分析驗證這些基因，結果顯示WEE1在四個基因中變化最顯著（圖3C-F）。因此，WEE1被選為KIAA1429的候選下游目標，以供進一步研究。WEE1蛋白水平在KIAA1429敲除細胞中升高，在KIAA1429過表達細胞中降低（圖3G，H）。根據IHC分析（圖3I），在KIAA1429基因敲除的異種移植組織中，WEE1表達上調。此外，結腸癌組織中WEE1的mRNA水平降低（圖3J），并且與結腸癌組織中KIAA1429的mRNA水平呈負相關（圖3K）。這些結果表明KIAA1429對WEE1的表達具有負調控作用。

4）KIAA1429通過WEE1介導的腫瘤增殖調控促進了結直腸癌的發生

qRT-PCR和western blot檢測證實沉默KIAA1429調控的增加的WEE1在WEEI敲除的DLD-1和LoVo細胞中表達明顯降低（圖4A，B）。WEE1的沉默逆轉了DLD-1和LoVo細胞中KIAA1429基因敲除抑制的細胞增殖和集落形成能力（圖4C-E）。細胞周期分析表明，敲除KIAA1429可增加G2期細胞的百分比，通過沉默WEE1可降低G2期細胞的百分比（圖4F）。與這些觀察結果一致，KIAA1429的敲除抑制了體內CRC腫瘤的生長，WEE1下調逆轉了這種效應（圖4G-I）。總之，這些發現表明KIAA1429通過調節結腸癌中WEE1的表達在促進腫瘤增殖中起著關鍵作用。

5）KIAA1429以非m6A依賴的方式調節WEE1的mRNA表達

RIP分析證實，在KIAA1429組中WEE1 mRNA顯著富集，但在IgG組中未富集（圖5A）。此外，在用Act D處理的DLD-1和LoVo細胞中敲除KIAA1429后，WEE1轉錄本的半衰期增加（圖5B）。這些結果表明KIAA1429與WEE1 mRNA結合，并以轉錄后方式降低WEE1 mRNA的穩定性。接著，我們檢測其是否以m6A依賴的方式調控WEE1的mRNA表達。結果表明，敲除KIAA1429不會改變m6A修飾的WEE1 mRNA水平（圖5C）。然而，METTL3基因敲除降低了WEE1 mRNA的m6A修飾水平（圖5D）。此外，METTL3敲除后，與KIAA1429相互作用的WEE1 mRNA的數量沒有明顯差異（圖5E）。這些結果表明KIAA1429不影響WEE1 mRNA的m6A水平，并且KIAA1429和WEE1之間的相互作用不受m6A修飾的影響。接下來，我們探討KIAA1429是否以m6A非依賴性方式降低WEE1 mRNA的穩定性。RIP序列結果顯示KIAA1429與WEE1 mRNA的結合位點位于3′-UTR。為了進一步確定KIAA1429和WEE1 mRNA之間的結合位點，我們將WEE1 mRNA的預測3′-UTR分為三個片段。WEE1 mRNA中3′-UTR的第三段被抗KIAA1429抗體顯著富集，但其他兩段未被該抗體富集（圖5F）。因此，我們對WEE1 mRNA的3′-UTR的第三段進行突變，以供進一步研究（圖5G）。KIAA1429沉默后熒光素酶活性增加，經WEE1-3’-UTR MT3挽救（圖5H）。綜上所述，這些結果表明KIAA1429通過以m6A非依賴性方式降低WEE1 mRNA的穩定性來下調WEE1的表達。

6）丁酸通過轉錄因子NFκB1抑制KIAA1429的表達

我們之前的研究報告，丁酸鹽是腸道菌群的代謝物，通過下調METTL3的表達抑制結直腸癌細胞增殖。因此，我們探討了KIAA1429的表達是否也受丁酸的調控。如圖6A所示，丁酸處理后KIAA1429的表達顯著降低。通過生物信息學分析，我們發現轉錄因子NFκB1可能與KIAA1429基因的啟動子區域結合。因此，我們推測丁酸可能通過降低NFκB1的表達來下調KIAA1429的表達。丁酸處理后，NFκB1和p-IKBα的mRNA和蛋白質表達水平顯著降低（圖6B，C）。此外，沉默NFκB1降低了KIAA1429的mRNA和蛋白質水平（圖6D-F）。在敲低NFκB1后，熒光素酶活性降低，這通過KIAA1429啟動子區域的突變得以挽救（圖6G）。

  結論：我們首次報道KIAA1429是CRC中一個潛在的預后標志物，它通過m6A獨立方式下調WEE1表達促進增殖。此外，KIAA1429在CRC組織中表達明顯升高，與CRC患者生存率低相關。丁酸通過抑制轉錄因子NFκB1降低KIAA1429的表達。這些發現可能為前瞻性的多機構試驗鋪平道路，以測試KIAA1429作為CRC患者的潛在預后標志物和治療靶點的臨床應用。

參考文獻：Ma L, Lin Y, Sun SW, Xu J, Yu T, Chen WL, Zhang LH, Guo YC, Wang YW, Chen T, Wei JF, Zhu LJ. KIAA1429 is a potential prognostic marker in colorectal cancer by promoting the proliferation via downregulating WEE1 expression in an m6A-independent manner. Oncogene. 2021 Nov 24. doi: 10.1038/s41388-021-02066-z. Epub ahead of print. PMID: 34819634.