小核仁RNA宿主基因7 (small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7) 的衍生lncRNA在包括肺腺癌（LUAD）在內(nèi)的多種癌癥中已被廣泛報(bào)道。然而，lncRNA SNHG7是否參與LUAD的多西他賽耐藥尚不清楚。本文發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)SNHG7的轉(zhuǎn)移增強(qiáng)了肺腺癌的多西他賽耐藥。本文于2021年10月發(fā)表在《Cancer Letter》IF：8.679雜志上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、SNHG7增強(qiáng)LUAD細(xì)胞對(duì)多西他賽的抗性

首先檢測(cè)SNHG7是否和LUAD細(xì)胞抵抗多西他賽有關(guān)，結(jié)果顯示與相應(yīng)的親代細(xì)胞相比，SNHG7在多西他賽耐藥的LUAD細(xì)胞系（H1299/DTX and SPC-A1/DTX）中高表達(dá)（圖1A）。敲除SNHG7后，H1299/DTX and SPC-A1/DTX對(duì)多西他賽的耐藥性顯著降低（圖1B-C），表明SNHG7增強(qiáng)LUAD細(xì)胞對(duì)多西他賽的抗性。此外，SNHG7在耐藥細(xì)胞和相應(yīng)的親代細(xì)胞中都主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，表明其增強(qiáng)耐藥性是通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

圖1 SNHG7增強(qiáng)LUAD細(xì)胞對(duì)多西他賽的抗性

2、SNHG7增強(qiáng)LUAD細(xì)胞的多西他賽抗性，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

為了研究SNHG7是否影響多西他賽對(duì)LUAD細(xì)胞的生物學(xué)功能，在有無(wú)多西他賽處理下進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。如圖2A-C所示，陳曼SNHG7降低了0或100μg/L多西他賽暴露后的H1299/DTX and SPC-A1/DTX細(xì)胞的增殖，但增加了細(xì)胞凋亡。在小鼠體內(nèi)，多西他賽抑制腫瘤生長(zhǎng)，減小腫瘤體積和重量，而這種作用在SNHG7敲除后進(jìn)一步被放大（圖2D-F）。因此，SNHG對(duì)多西他賽在LUAD細(xì)胞中的抗腫瘤作用有負(fù)面影響。

眾所周知M2極化的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞會(huì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和化學(xué)抗性。所以作者想知道SNHG7是否會(huì)影響巨噬細(xì)胞M2極化。結(jié)果顯示IL-3處理巨噬細(xì)胞增加了M2標(biāo)志物的表達(dá)，包括CD206和ARG1，但是敲除SNHG7會(huì)反轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)（圖2G-H）。此外，IL-3處理增加了CD11b+CD206+標(biāo)記的巨噬細(xì)胞比例，但敲除SNHG7會(huì)反轉(zhuǎn)這種作用（圖2I）。這些結(jié)果表明SNHG7正向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2極化。

圖2 SNHG7增強(qiáng)LUAD細(xì)胞的多西他賽抗性，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

3、SNHG7通過(guò)調(diào)節(jié)ATG5和ATG12誘導(dǎo)多西他賽耐藥的LUAD細(xì)胞自噬

自噬在調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥中發(fā)揮著重要作用，所以作者猜測(cè)SNHG7可能通過(guò)自噬促進(jìn)耐藥，于是檢測(cè)了敲除SNHG7后耐藥細(xì)胞H1299/DTX和SPC-A1/DTX中自噬相關(guān)基因的表達(dá)。如圖3A所示，WB表明敲除SNHG后暴露0或100μg/L多西他賽 H1299/DTX and SPC-A1/DTX細(xì)胞中LC3I/II, ATG5, ATG12的表達(dá)顯著降低，但不影響ATG7和ULK1；100μg/L多西他賽處理顯著降低了H1299/DTX and SPC-A1/DTX細(xì)胞中LC3-II/LC3-1, ATG5, ATG7, ATG12, and ULK1水平，但同時(shí)敲除SNHG7只增強(qiáng)了多西他賽導(dǎo)致的LC3I/II, ATG5, ATG12的表達(dá)降低作用。這表明SNHG7正調(diào)節(jié)自噬通過(guò)ATG5和ATG12。此外，免疫熒光顯示敲除SNHG7可以減少自噬小體和ATG5和ATG12蛋白水平，但是沒(méi)有改變其mRNA水平，并且熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示SNHG7不能改變ATG5和ATG12的啟動(dòng)子熒光素酶活性（圖3B-D），表明SNHG7不是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ATG5和ATG12。

圖3 SNHG7通過(guò)調(diào)節(jié)ATG5和ATG12誘導(dǎo)多西他賽耐藥LUAD細(xì)胞自噬

4、SNHG7招募HuR以穩(wěn)定ATG5和ATG12從而影響LUAD細(xì)胞的增殖、凋亡和多西他賽耐藥

接下來(lái)，研究SNHG7如何調(diào)控ATG5和ATG12。首先進(jìn)行RNA pulldown實(shí)驗(yàn)獲得與antisense比較在，senseSNHG7中差異的蛋白條帶，然后用MS識(shí)別差異條帶，獲得與SNHG7相互作用的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUL4A和HuR在senseSNHG7中顯著富集（圖4A-B）。RIP證實(shí)SNHG7可以被HuR抗體富集沉淀（圖4B-C）。RIP證明HuR和ATG5和ATG12有結(jié)合作用（圖4D-E），并且，敲除SNHG7減少了ATG5和ATG12和HuR的結(jié)合（圖4F）。此外，敲除SNHG7或HuR的表達(dá)都會(huì)顯著降低ATG5和ATG12的mRNA穩(wěn)定性（圖4G-H）。以上結(jié)果表明SNHG7招募HuR以穩(wěn)定ATG5和ATG12。

之后作者通過(guò)拯救實(shí)驗(yàn)證明SNHG是通過(guò) ATG5和ATG12影響LUAD細(xì)胞的增殖、凋亡和多西他賽耐藥性的（結(jié)果未展示）。

圖4 SNHG7招募HuR穩(wěn)定ATG5和ATG12

5、多西他賽耐藥LUAD細(xì)胞分泌的外泌體SNHG促進(jìn)LUAD的耐藥性和巨噬細(xì)胞M2極化

如圖5A-D所示，分離獲得了耐藥性LUAD細(xì)胞系H1299/DTX and SPC-A1/DTX的外泌體，隨后這些被PKH67標(biāo)記的外泌體顯示分布在H1299/DTX and SPC-A1/DTX的細(xì)胞質(zhì)中。之后，將這些外泌體和SNHG7敲除或未敲除的巨噬細(xì)胞共孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體處理組M2標(biāo)志物顯著上調(diào)，但是當(dāng)同時(shí)敲除SNHG7后，這種上調(diào)作用被減弱（圖5E-F）。類(lèi)似的，CD11b+CD206+巨噬細(xì)胞比例在外泌體處理組顯著上調(diào)，在SNHG7+外泌體組顯著回落（圖5G）。表明耐藥性LUAD細(xì)胞來(lái)源外泌體SNHG7促進(jìn)LUAD細(xì)胞的耐藥性和巨噬細(xì)胞M2極化。

圖5來(lái)自多西他賽耐藥LUAD細(xì)胞的外泌體SNHG7促進(jìn)LUAD細(xì)胞的多西他賽耐藥和巨噬細(xì)胞M2極化

6、SNHG7通過(guò)招募CUL4A增加PTEN泛素化水平，激活PI3K/AKT通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

隨后探究SNHG7調(diào)控M2極化的機(jī)制。作者首先篩選了9條常見(jiàn)的信號(hào)通路，并進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有PI3K/AKT信號(hào)通路的熒光素酶信號(hào)在SNHG敲除后顯著下降（圖6A）。隨后WB驗(yàn)證表明敲除SNHG7會(huì)顯著抑制外泌體處理的巨噬細(xì)胞AKT的磷酸化，但對(duì)其mRNA的表達(dá)無(wú)影響（圖6B-C）。亞細(xì)胞定位也顯示外泌體處理的巨噬細(xì)胞中SNHG7主要定位與細(xì)胞質(zhì)（圖6D）。之后過(guò)表達(dá)SNHG7的同時(shí)用蛋白合成抑制劑CHX處理外泌體孵育后的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SNHG7后PTEN蛋白穩(wěn)定性下降，并且外泌體處理的巨噬細(xì)胞中PTEN的泛素化增加了，而MG132阻斷了這種SNHG過(guò)表達(dá)對(duì)PTEN泛素化的抑制作用（圖6E）。

此外，之前的MS鑒定到的CUL4A是一個(gè)泛素化相關(guān)蛋白。所以作者推測(cè)SNHG7可能通過(guò)招募CUL4A調(diào)控PTEN的泛素化。FISH-IF共染證明了CUL4A和SNHG7之間的共定位（圖6F），RIP和RNA pulldown證實(shí)了兩者間的結(jié)合關(guān)系（圖6G-H）。此外，co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PTEN可以被CUL4A富集沉淀，而這種富集在過(guò)表達(dá)SNHG7之后顯著上調(diào)。以上表明SNHG7是通過(guò)招募CUL4A調(diào)控PTEN的泛素化。

圖6 SNHG7通過(guò)招募CUL4A促進(jìn)PTEN泛素化激活PI3K/AKT通路

綜上所述，本研究表明外泌體SNHG7通過(guò)誘導(dǎo)LUAD細(xì)胞自噬和促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化促進(jìn)LUAD細(xì)胞多西他賽耐藥。機(jī)制上，SNHG7招募HuR穩(wěn)定ATG5和ATG12，誘導(dǎo)LUAD細(xì)胞自噬。同時(shí)，耐多西他賽的LUAD細(xì)胞分泌外泌體SNHG7，促進(jìn)親代LUAD細(xì)胞耐多西他賽。此外，外泌體SNHG7通過(guò)招募CUL4A促進(jìn)PTEN泛素化，激活PI3K/AKT通路，觸發(fā)巨噬細(xì)胞M2極化。

圖7 SNHG7誘導(dǎo)LUAD細(xì)胞多西他賽耐藥和巨噬細(xì)胞M2極化的分子機(jī)制

參考文獻(xiàn)：

Zhang Kai., Chen Jing., Li Chen., Yuan Yuan., Fang Surong., Liu Wenfei., Qian Yingying., Ma Jiyong., Chang Ligong., Chen Feifei., Yang Zhenhua., Gu Wei.(2021). Exosome-mediated transfer of SNHG7 enhances docetaxel resistance in lung adenocarcinoma. Cancer Lett, undefined (undefined), undefined. doi:10.1016/j.canlet.2021.10.029