多發性骨髓瘤（MM）是一種惡性腫瘤，起源于骨髓中產生病理性抗體的漿細胞的廣泛增殖，約占血液腫瘤的10%。目前，許多研究已經證明，MM患者具有相同的遺傳特征；因此，MM被認為是遺傳變異累積的結果。然而，MM的發展是一個復雜的病理過程，需要進一步研究。蛋白精氨酸甲基轉移酶5（PRMT5）是一種參與多種血液惡性腫瘤腫瘤細胞進展的酶。有研究發現抑制PRMT5的活性增加了CASP1的表達，促進了MM細胞焦亡。PRMT5的高表達或CASP1的低表達與MM的總體生存率低相關。該研究2021年9月發表在《Cell Death and Disease》，IF: 8.469。

技術路線：

主要研究結果：

1.   PRMT5在MM中過表達

作者對來自Oncomine數據庫的7個MM數據集進行了生物信息學分析。與非癌組織相比，發現MM組織中PRMT5顯著上調（P=0.020，圖1A）。此外，結合MMRF CoMMpass（n=859）和基因型組織表達（GTEx）數據庫（n=62）進行了生物信息學分析，表明PRMT5在MM組織中的表達高于非癌組織（P=0.00034，圖1B）。通過分析MMRF CoMMpass數據庫中787例MM患者的臨床數據，發現高PRMT5表達與較差的無進展生存率相關（P=0.015，HR=1.472，圖1C）。PCR結果同樣發現MM樣品中的PRMT5水平顯著高于對照樣品，而MGU樣品中未觀察到顯著變化（圖1D）。包括MGUS樣本（GSE6477和GSE5900）在內的數據集顯示，健康和MGUS患者之間PRMT5的表達沒有差異。此外，通過使用蛋白質印跡分析，發現PRMT5蛋白在MM樣本和MM細胞系中過度表達（圖1E，F）。

圖1 PRMT5在MM中過表達

2.  PRMT5基因敲除觸發MM細胞膜破裂和PI+/Annexin V+增加

設計干擾PRMT5表達的實驗，通過western blotting和qRT-PCR驗證（圖2A，B），并且這些結果在兩種細胞系中靶向PRMT5的免疫熒光也進一步證實（圖2C）。通過流式細胞術證實，敲除PRMT5可增加NCI-H929和U266細胞的PI+數量，尤其是在PI+/Annexin V+結構域（圖2D）。這種表型可能是指晚期凋亡或焦亡，兩者都表現為細胞膜兩極引起的PI染色。由于CASP3的激活是細胞凋亡執行途徑的觸發因素，作者分析了sh-PRMT5細胞和陰性對照細胞中裂解的CASP3的表達，但結果無顯著性（圖2E）。此外，TEM圖像顯示sh-PRMT5細胞具有細胞質腫脹和質膜破裂，這支持了細胞焦亡的形態學（圖2F）。這些結果表明，PRMT5的敲除激活MM細胞系的焦亡。

圖2 PRMT5激活MM細胞系焦亡

3.   PRMT5上調與CASP1呈負相關

使用Affymetrix Clariom S陣列芯片對三個NCI-H929細胞樣本和三個PRMT5敲除（PRMT5 kd）NCI-H929細胞樣本進行基因組陣列，以確定PRMT5在MM發病機制中的功能（圖3A）。結果顯示，NCI-H929和U266細胞中的CASP1均顯著增加（圖3B）。為了證實CASP1作為PRMT5的下游靶點，與陰性對照組相比，作者評估了轉染PRMT5-shRNA-2后MM細胞系中CASP1和裂解的CASP1的蛋白表達水平。值得注意的是，PRMT5的敲除導致CASP1和裂解的CASP1顯著升高，表明在MM細胞中，PRMT5使CASP1沉默（圖3C）。此外，MM患者骨髓源漿細胞CASP1 mRNA表達顯著降低，與PRMT5呈負相關（圖3D, E）。

圖3 PRMT5上調與CASP1呈負相關

4.   在MM細胞系中敲除CASP1可以挽救PRMT5缺失引起的焦亡現象

為了研究PRMT5是否通過抑制CASP1表達來調節細胞熱下垂，在NCI-H929和U266細胞中瞬時過表達CASP1（圖4A）。結果顯示，CASP1過表達顯著抑制了NCI-H929和U266細胞的細胞活力（補充圖1B），并增加了PI+/Annexin V+細胞的數量（圖4B）。結果表明，CASP1的過度表達增強了GSDMD的激活和白細胞介素-1β（IL-1b）和白細胞介素-18（IL-18）的分泌（圖4C）。同樣，在PRMT5缺失的細胞中，CASP1表達升高，激活了焦亡途徑。然而，當PRMT5缺失細胞中的siRNA敲除CASP1時（圖4D），焦亡途徑的標記物顯著下調，焦亡細胞的百分比顯著降低（圖4E，F）使用小鼠異種移植模型進行了體內實驗，發現CASP1的敲除部分逆轉了體內PRMT5缺失的NCI-H929細胞的增殖缺陷（圖4G，H）。上述結果表明，PRMT5缺失引起的細胞焦亡通過敲除CASP1得以挽救。

圖4通過敲除CASP1挽救了PRMT5缺失引起的細胞焦亡

5.  使用PRMT5抑制劑GSK591處理可降低CASP1啟動子H4R3me2s水平

檢測PRMT5是否直接調控CASP1的表達，并通過ChIP檢測和qRT-PCR分析了PRMT5介導的H4R3me2s在CASP1基因啟動子周圍的富集情況。結果表明，與對照組相比，在PRMT5缺失的NCI-H929和U266細胞中，CASP1啟動子區域的H4R3me2s水平顯著降低（圖5A）。為了抑制CASP1基因啟動子上的H4R3me2s，用PRMT5的特異性抑制劑-GSK591處理NCI-H929和U266細胞。用0、1、5和10μM GSK591（B6182，Apexbio）處理NCI-H929和U266細胞，以研究其生物學功能。結果發現，5μM GSK591處理顯著觸發NCIH929和U266細胞中PI+細胞比例的增加，表明膜破裂和繼發性細胞死亡由熱下垂引起（圖5B）。接下來，作者檢測了不同濃度GSK591處理的NCI-H929和U266細胞中CASP1的表達，以探討抑制PRMT5的酶活性是否可以重新激活CASP1的表達。發現5μM GSK591增加了CASP1的表達（圖5C）。這些結果表明，GSK591通過抑制PRMT5降低H4R3me2s水平，從而激活CASP1介導的細胞焦亡。

圖5 PRMT5抑制劑GSK591處理后CASP1啟動子H4R3me2s水平降低

6.  PRMT5的高表達和CASP1的低表達與MM患者較差的臨床預后相關

作者收集了108例新診斷的MM患者的臨床資料，并通過免疫組織化學測定了PRMT5和CASP1的表達水平。MM患者的骨髓組織分為PRMT5高組和PRMT5低組（圖6A），以及CASP1高組和CASP1低組（圖6B）。在MM患者中觀察到PRMT5表達與ISS分期之間存在顯著相關性（表1）。此外，Kaplan-Meier曲線（圖6C，D）表明，高PRMT5表達（P=0.022）和低CASP1表達（P=0.00063）與MM總體存活率低相關。合并這兩種變體，發現與PRMT5高表達和CASP1低表達的患者相比，PRMT5低表達和CASP1高表達的患者的生存率顯著降低（圖6E，P=0.0037）。此外，單變量（P<0.001）和多變量（P=0.007）Cox比例風險回歸分析均表明PRMT5上調是MM患者生存率低的獨立預后風險因素（表2）。

圖6 在MM患者中，PRMT5的高表達和CASP1的低表達與較差的臨床預后相關

表1 PRMT5表達與MM臨床病理特征的關系

表2 MM患者生存的單因素和多因素臨床病理特征分析

主要結論：

該研究結果表明，PRMT5通過沉默CASP1在MM中調節細胞焦亡，PRMT5抑制劑GSK591可能作為MM的潛在治療藥物。

參考文獻：

Xia T, Liu M, Zhao Q, Ouyang J, Xu P, Chen B. PRMT5 regulates cell pyroptosis by silencing CASP1 in multiple myeloma. Cell Death Dis. 2021; 12(10):851.